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目的观察缺血缺氧和压力等局部微环境变化对小鼠黑色素瘤线形程序性坏死(Linearly Patterned Programmed Cell Necrosis, LPPCN)的数量及分布规律的影响。分析不同局部微环境中黑色素移植瘤的生长速度和方式,血管生成模式以及肿瘤侵袭能力的差别,初步阐明线形程序性坏死发生的相关信号转导通路及其作为血管生成拟态(Vasculogenic Mimicry, VM)形成的空间结构基础的重要意义,丰富肿瘤血管生成相关理论。方法1.动物模型的建立缺血缺氧模型的建立：注射B16黑色素瘤细胞悬液到C57小鼠双侧后肢肌肉,通过结扎荷瘤的C57小鼠一侧后肢股动脉建立B16后肢缺血移植瘤模型。成瘤15d后处死小鼠,剖取移植瘤,福尔马林溶液固定,石蜡包埋制作组织切片。生物力学模型的建立：注射B16瘤细胞悬液到C57小鼠后肢肌肉和腹腔内,成瘤9d后处死小鼠。每组小鼠分别剖取移植瘤,福尔马林溶液固定,石蜡包埋制作组织切片。2.分析LPPCN与VM形成的相关分子机制在石蜡切片上对比研究B16黑色素瘤在正常环境和缺血缺氧环境、高压微环境和低压微环境下肿瘤的生长方式、LPPCN数目及其分布规律、VM数目以及浸润转移能力等形态学和相关分子机制变化,揭示LPPCN形成的相关分子机制。结果1.小鼠黑色素瘤中存在LPPCNC57小鼠B16黑色素瘤中存在线形或网络状排列的胞核深染、碎裂,胞浆浓缩、凝集,胞间连接消失的LPPCN细胞。这些条带状结构常常与周围的内皮依赖性血管相连通,有时可以见到由LPPCN条索围成的管道,内有红细胞。并且不同LPPCN条带与周围内皮依赖性血管之间的距离近乎相等。2.各组肿瘤组织LPPCN数目的差别缺血模型中,缺血组的LPPCN计数(11.25±6.04)和LPPCN细胞计数(51.73±25.06)大于对照组(5.50±3.34；16.50±4.01),差别有统计学意义(P<0.05)；生物力学模型中,LPPCN计数(13.80±6.05)和LPPCN细胞计数(56.46±28.36)大于腹腔组(6.67±3.12；16.98±8.69),差别有统计学意义(P<0.05)。3. LPPCN细胞免疫组化染色结果散发性程序性坏死(Scattered Patterned Programmed Cell Necrosis, SPPCN,即LPPCN形成的早期阶段)细胞Bcl-2染色指数(3.68±1.37)大于LPPCN细胞Bcl-2染色指数(2.15±1.16)；SPPCN细胞Bax染色指数(2.10±0.79)小于LPPCN细胞Bax染色指数(4.35±1.20)。差异均有统计学意义(P<0.05)。各组LPPCN细胞Caspase-3染色指数、Caspase-9染色指数及Bax染色指数均大于LPPCN周围肿瘤细胞,差别有统计学意义(P<0.05)。4.侵袭相关蛋白的表达情况缺血组的HIF-1 a染色指数(3.38±1.93)大于对照组HIF-1 a染色指数(1.75±0.71)；后肢组的HIF-1 a染色指数(3.10±1.60)大于腹腔组HIF-1 a染色指数(1.89±0.60),差别有统计学意义(P<0.05)；缺血组MMP-2染色指数(3.00±0.76)、后肢组MMP-2染色指数(4.10±0.88)分别大于对照组MMP-2染色指数(1.38±0.52)和腹腔组MMP-2染色指数(3.00±1.12),差别有统计学意义(P<0.05)；缺血组MMP-9染色指数(4.00±0.93)、后肢组MMP-9染色指数(4.40±0.70)分别大于对照组MMP-9染色指数(2.50±0.76)和腹腔组MMP-9染色指数(2.22±0.44),差别有统计学意义(P<0.05)；MMP-2、MMP-9染色指数与LPPCN计数分别呈正相关(r=0.402,P=0.017；r=0.533,P=0.001)；缺血组Twist1染色指数(3.25±0.89)、后肢组Twist1染色指数(4.00±0.94)分别大于对照组Twist1染色指数(1.88±0.84)和腹腔组Twistl染色指数(2.44±0.88),差别有统计学意义(P<0.05)。5.各组肿瘤组织VM计数的差别缺血组VM计数(6.13±0.99)大于对照组VM计数(2.13±1.13)；后肢组VM计数(9.40±4.48)大于腹腔组VM计数(3.44±1.01),差别均有统计学意义(P<0.05)。6. LPPCN与VM之间的关系LPPCN计数、LPPCN细胞计数与VM数目分别呈正相关(r=0.551,P=0.001)；(r=0.613,P=0.000)。结论1.肿瘤局部缺血缺氧和压力变化可以诱导肿瘤细胞发生LPPCN; LPPCN可能是肿瘤细胞在局部缺血缺氧环境和高压微环境下发生的不同于传统凋亡和坏死的一种新的主动性死亡方式,其死亡途径最终可能是经由与线粒体凋亡途径类似的分子事件调控,但形态学上却表现为坏死细胞的特征。2.肿瘤局部缺氧微环境和间质液体压力(Interstitial Fluid Pressure, IFP)对肿瘤细胞侵袭能力和VM形成有重要影响。在缺氧环境下以及肿瘤局部IFP增加时,黑色素瘤细胞高表达HIF-1 a,同时出现MMP-2、MMP-9以及Twist1的表达上调,从而促进肿瘤细胞的侵袭能力,参与VM形成过程中的细胞外基质重塑进而促进VM的形成。3.在凋亡相关蛋白的调控下,部分肿瘤细胞可形成LPPCN, LPPCN的形成可能是VM和内皮依赖性血管形成的空间结构基础。LPPCN作为程序性坏死的一种特殊的死亡模式,其形成的机制及意义尚不完全明确。通过对其分子机制的研究,一方面可以丰富关于细胞死亡模式的理论,另一方面可能解释在具有较高压力的肿瘤组织内,其周围组织内的血管通过何种机制伸入到瘤组织内并最终改善肿瘤的微循环,从而进一步为肿瘤血管生成拟态学说提供理论依据。同时,如能以LPPCN形成过程中的关键分子为靶点,抑制LPPCN的形成,使快速生长的肿瘤中无法形成VM和内皮依赖性血管生成所需的空间,从而导致肿瘤组织的大面积坏死,则有可能找到抗血管治疗肿瘤的新途径和新靶点,解决临床上传统抗肿瘤血管生成治疗不佳的难题。