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目的:探讨肠道菌群对PD-1抑制剂治疗结直肠癌疗效的影响及其代谢与免疫机制。方法:1. 临床研究收集具有完整临床资料的结直肠癌病例73例,应用免疫组织化学染色法对肿瘤组织中PD-1、Tim-3的表达进行评估,并分析其表达水平对患者预后的影响。2.基础实验64只SPF级雄性BALB/c小鼠(7周龄),随机分为A组、a组、B组、b组、D组、d组、E组、e组。A组、a组给予无菌饮用水喂养,B组、b组给予万古霉素无菌饮用水溶液(浓度:0.25mg/m L)喂养,D组、d组给予黏菌素硫酸盐溶液(浓度:2mg/m L)喂养,E组、e组给予联合抗生素无菌饮用水溶液(浓度:氨苄西林钠1mg/m L,硫酸链霉素5mg/m L,黏菌素硫酸盐1mg/m L)喂养;抗生素喂养持续至实验结束。喂养至2周时,评价抗生素达到抑菌效果后,应用结肠癌细胞系CT26建立皮下移植瘤模型,待肿瘤体积长至50mm~3-100mm~3时,A组、B组、D组、E组给予PD-1抑制剂治疗,a组、b组、d组、e组给予PD-1同型对照抗体(Ig G2a)治疗。给药方式均为腹腔注射,250μg/只,隔3d一次,共注射5次,末次给药后再观察5d结束实验,留取粪便、肿瘤及血清标本。每次治疗前及处死前测量肿瘤体积并留取粪便标本,观察PD-1抑制剂在各治疗组间的治疗效果。对各不同治疗组小鼠粪便标本应用16S r DNA测序技术、宏基因组测序技术进行分析,筛选影响PD-1抑制剂疗效的关键菌群并预测功能通路。3.机制探讨应用代谢组学技术对小鼠血清标本进行分析,筛选差异代谢产物并预测关键代谢通路;应用流式细胞术、酶联免疫吸附实验、免疫组织化学染色技术对外周血免疫状态及肿瘤免疫微环境进行评估,通过相关性分析探讨肠道菌群影响PD-1抑制剂疗效的代谢及免疫机制。结果:1. 结直肠癌组织中存在PD-1、Tim-3的表达;PD-1表达情况与淋巴结转移及TNM分期密切相关(P<0.05),且其表达水平与预后呈明显负相关(P<0.05);Tim-3的表达与PD-1的表达无相关性,与临床病理参数之间也未见明显相关性;PD-1、Tim-3双表达的病例预后最差(45.00%vs.84.91%,P<0.05)。2. 在应用PD-1抑制剂治疗的各组中,A组、B组的治疗效果明显优D组、E组(P<0.05),应用PD-1同型对照抗体的a组、b组、d组、e组间肿瘤体积差异无统计学意义。E组小鼠粪便仅提取出微量DNA,未能进行测序;A组、B组、D组肠道菌群分析显示,D组拟杆菌属(Bacteroides)的丰度明显高于A组和B组(P<0.05),而普雷沃菌属CAG:485种(Prevotella＿sp.＿CAG:485)、狄氏副拟杆菌(Parabacteroides＿distasonis)、阿克曼氏菌(Akkermansia＿muciniphila)、单形拟杆菌(Bacteroides＿uniformis)的丰度在A、B两组明显高于D组(P<0.05);宏基因组学差异基因功能富集分析显示,肠道菌群可能通过氨基酸的合成和代谢途径、甘油磷脂的代谢途径及某些免疫信号通路影响PD-1抑制剂治疗结直肠癌的疗效。3. 血清代谢产物在不同治疗组间存在明显差异,而代谢通路主要富集于甘油磷脂代谢通路;溶血磷脂类代谢产物Lyso PC(17:0)的浓度在D组、E组明显高于A、B两组(P<0.05),与Prevotella＿sp.＿CAG:485的丰度呈明显负相关(r=-0.68,P<0.05);Lyso PC[20:4(8Z,11Z,14Z,17Z)]的浓度在A组、B组明显高于D、E两组(P<0.05),与Prevotella＿sp.＿CAG:485的丰度呈明显正相关(r=0.51,P<0.05);肿瘤微环境中IFN-γ、IL-2的表达水平在A组、B组均高于D、E两组,其中A组表达水平最高,差异有统计学意义(P<0.05);小鼠外周血CD4+T、CD8+T细胞比例在各组间无明显差异。结论:1.结直肠癌组织中PD-1的表达水平与患者预后呈负相关;PD-1的表达与Tim-3的表达无明显相关性;PD-1、Tim-3表达水平的联合分析对判断CRC患者的预后有较大的临床意义。2.肠道菌群影响PD-1抑制剂治疗结直肠癌的疗效,肠道内拟杆菌属(Bacteroides)丰度的升高可能是导致PD-1抑制剂治疗结直肠癌失败的重要原因,而Prevotella＿sp.＿CAG:485、Parabacteroides＿distasonis、Akkermansia＿muciniphila、Bacteroides＿uniformis丰度的增加与PD-1抑制剂较好的疗效相关。3. 血清溶血磷脂胆碱类代谢物的浓度与PD-1抑制剂治疗结直肠癌的疗效相关,并伴随着肿瘤微环境中免疫状态的改变。因此,肠道菌群可能通过影响甘油磷脂类物质的代谢调控着肿瘤免疫微环境的改变,进而影响了PD-1抑制剂治疗CRC的疗效。