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第一部分题目:四氢姜黄素对创伤性脑损伤后自噬及神经功能的影响目的:研究创伤性脑损伤(TBI)后四氢姜黄素(THC)对自噬及神经功能的影响,并探讨THC是否通过诱导自噬产生神经保护作用。方法:1.实验动物模型建立及分组:选择成年雄性SD大鼠,采用改良的Feeney法建立实验动物模型。实验动物随机分为假手术组(Sham),TBI组,TBI+溶剂组,TBI+THC 组。2.药物的处理:THC溶于1%二甲基亚砜中,TBI后1h腹腔注射给药,24h重复给药。TBI+溶剂组给予等量1%二甲基亚砜。3.Western blot检测:按照不同的时间点以及药物浓度处理后,取实验动物脑损伤灶周边脑皮层组织,检测自噬相关蛋白LC3和Becl in-1水平。4.神经功能评分:在TBI后24 h检测神经功能恢复情况,神经功能评分量表分值低代表神经功能损伤严重。5.脑组织含水量检测:取各组实验动物的大脑皮层,称取湿重后,将标本置于80℃烘箱内72 h,再称取标本干重,根据公式检测脑组织含水量。结果:1.TBI 组 LC3-Ⅱ 和 Beclin-1 的表达增加(p<0.01);THC 处理后,LC3-Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达随着THC浓度的增加而增加,THC浓度为25mg/kg时LC3-Ⅱ 和 Beclin-1 表达最高(p<0.001)。2.THC(25 mg/kg)处理后,随时间延长LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达逐渐增加然后降低,在THC处理24h时表达最高(p<0.01)。3.TBI组和TBI+溶剂组在伤后24 h神经功能评分明显降低(p<0.001),THC处理后,神经功能评分明显增加(p<0.01);TBI后脑组织含水量显著增加(p<0.001);THC处理后脑组织含水量明显减少。4.TBI组含尼氏小体的正常神经细胞数量明显减少(p<0.001);THC处理后显著改善神经细胞的存活率(p<0.05)。结论:1.THC可以增强创伤性脑损伤后自噬的表达。2.THC可以减轻大鼠创伤性脑损伤后脑水肿,改善创伤性神经功能障碍,具有神经保护作用。第二部分题目:四氢姜黄素通过调控自噬减轻线粒体途径诱导的神经细胞凋亡目的:探讨THC是否通过活化自噬减轻TBI后氧化应激诱导的凋亡,阐明THC诱导的自噬活化在继发性脑损伤中的作用机制。方法:1.实验动物模型建立及分组:采用改良的Feeney法建立实验动物模型,实验动物随机分为假手术组(Sham),TBI组,TBI+溶剂组,TBI+THC组。2.氧化应激检测:MDA代表脂质过氧化;GPx代表抗氧化活性指标。根据试剂盒说明书操作流程进行检测,评估脑创伤后氧化应激程度。3.TUNEL检测:各组实验动物脑组织制作的石蜡切片,固定后根据TUNEL检测试剂盒说明书流程检测神经元凋亡数量。4.Western blot检测:检测线粒体凋亡途径相关蛋白:Bax、Bcl-2、Cytochrome-c 和 Cleaved caspase-3 及 LC3 和 Beclin-1 的表达变化。结果:1.与TBI组相比,THC处理后MDA的表达显著减少(p<0.05);同时GPx活性明显增强(p<0.01)。2.TBI组凋亡标志性蛋白Cleaved caspase-3的表达显著增加(p<0.001),THC处理可显著减少Cleaved caspase-3的表达(p<0.05)。3.TBI组TUNEL 阳性细胞的数量明显增加(p<0.001);THC处理后,可显著减少TBI后细胞凋亡数量(p<0.05)。4.与Sham组相比,TBI组线粒体中的Bax表达增加(p<0.001),而Bcl-2和Cytochrome c的表达减少(p<0.001),而在去线粒体胞浆中,Bax的表达减少(p<0.001),Bcl-2 和 Cytochrome c 的表达增加(p<0.001);THC 处理后,相对于TBI+溶剂组,线粒体中Bax的表达减少(p<0.05),Bcl-2和Cytochrome c表达增加(p<0.01),胞浆中Bax的表达增加(p<0.01),Bcl-2和Cytochrome c表达减少(p<0.01)。5.THC+3-MA 同时处理时,相对于TBI+THC组,胞浆蛋白中LC3-II和Beclin-1的表达减少(p<0.001);线粒体凋亡相关蛋白Bax表达减少(p<0.01),Cleaved caspase-3 表达增加(p<0.05)。结论:1.THC减轻TBI后氧化应激的程度。2.THC通过调控自噬减轻线粒体凋亡途径诱导的细胞凋亡。第三部分题目:四氢姜黄素通过调控PI3K/AKT/mTOR通路诱导自噬活化目的:探讨THC在创伤性脑损伤后如何诱导自噬表达及其调控通路,阐明THC活化自噬的机制,为临床治疗TBI提供实验依据。方法:1.所有实验动物随机分为4组:假手术组(Sham),TBI组,TBI+THC组,TBI+THC+LY294002组。每组动物数量为6只,用于Western blot检测。最后进行数据汇总并统计分析。2.Western blot检测:检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白:AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR的表达变化及自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达。结果:1.TBI后p-AKT和p-mTOR表达量相对于Sham组明显增加,THC处理后p-AKT和p-mTOR的表达显著降低(p<0.01);联合应用PI3K抑制剂LY294002,p-AKT 和 p-mTOR 的表达进一步降低(p<0.01)。2.应用PI3K抑制剂LY294002后,LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达相对于TBI+THC 组显著增加(p<0.01;p<0.05)。结论:1.THC可抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的活化。2.THC可能通过调控PI3K/AKT/mTOR通路诱导自噬表达。