研究背景和研究目的哺乳动物雷帕霉素靶点(mechanistic target of rapamycin,MTOR 或者mammalian target of rapamycin,mTOR)蛋白控制多种细胞生理过程,包括细胞凋亡、细胞自噬、翻译、能量代谢和炎症。MTOR的抑制剂雷帕霉素和它的衍生物已经在临床上用于免疫排斥和抗肿瘤。然而在一些情况下应用MTOR的抑制剂可以引起很多副作用。有研究表明通过激活MTOR信号通路可以缓解这些副作用。但是,现在为止还没有发现任何MTOR的化学激活剂。我们之前的研究发现一种新型丁内酯衍生物3-苄基-5-(2-硝基苯氧甲基)-γ-丁内酯(3BDO)能够通过磷酸化MTOR的底物RPS6KB1,选择性的保护神经细胞。我们推断3BDO可能激活了 MTOR。但是,该化合物的直接靶点以及其调控的因子并不明确。因此,在本研究中我们将首先鉴定3BDO的靶蛋白,明确其是否是MTOR的激活剂,并利用3BDO发现位于MTOR信号通路下游的新关键因子。已有研究表明,3’UTR相关的RNA(uaRNA),即来自3’UTR的长非编码RNA,可以独立表达,在胚胎发育和细胞分化调控过程中发挥重要作用。但是由于uaRNA在基因中的独特位置,很难通过传统的遗传学方法,设计特异性的siRNA和shRNA阻断其功能。因此,尽管目前发现很多uaRNA在胚胎发育过程中发生了明显的变化,却很难研究其具体的功能和作用机制。目前急需找到选择性地控制uaRNA水平的方法和工具。我们在鉴定3BDO的靶点为FKBP1A,并且是MTOR的激活剂之后,利用3BDO和基因组学技术,发现了位于MTOR信号通路下游的一个新关键因子—FLJ11812 uaRNA,并证明3BDO能选择性地降低FLJ11812的水平,因此,3BDO是研究该uaRNA功能的一个新的有力的工具。胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)来源于早期胚胎囊胚期的内细胞团,是一种能够在体外长期培养的多能干细胞。ESCs是研究胚胎发育和细胞分化机制最好的模型,尤其是在人类发育机理研究中,ESCs的应用更重要。为了研究FLJ11812在胚胎发育及分化中的作用,我们以人胚胎干细胞为模型,利用3BDO研究FLJ11812对人胚胎干细胞的干性维持及分化的影响,确定FLJ11812在人类胚胎发育中的作用机理。ESCs具有分化的多能性(pluriptency),能够分化为220多种成体细胞,其中包括血管内皮细胞。血管内皮细胞(Vascular Endothelial Cells,VECs)是多种器官和组织再生的重要组分。血管内皮细胞在血栓与止血、血管生成、辐射损伤、炎症及免疫反应等一系列重要的病理生理过程中起着重要的作用。在细胞治疗和临床应用中,种子内皮细胞的缺乏,增加了多种疾病的死亡率。因此,急需解决临床应用中所需的内皮细胞来源。在我们实验室之前的研究中,发现一种新型苯并噁嗪衍生物(2,3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-1,4-苯并噁嗪,ABO)能够通过上调Hmbox1诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化。但是,骨髓间充质干细胞在体外培养中容易老化,并且增殖有限,所以在临床应用中受到很大限制。因此,在本论文中,我们研究了ABO是否能够诱导ESCs向VECs分化?哪一种手性ABO在其中发挥关键作用?ABO调控ESCs向VECs分化的关键因子和信号通路是什么?据上述背景,本论文从化学生物学的角度出发,以具有生物活性的化学小分子为工具,旨在发现在胚胎干细胞干性维持中发挥重要作用的新因子和新通路,研究调控胚胎干细胞向血管内皮细胞分化的新因子和新通路,为阐明胚胎发育的调控机制提供新证据,为血管疾病的防治提供新的思路和理论依据。研究内容1.鉴定3BDO的靶蛋白,并鉴定其是否可以作为MTOR的激活剂。2.研究激活MTOR信号通路后其下游调控的关键因子。3.研究TIA1是否参与3’UTR相关的RNA——FLJ11812的加工。4.研究FLJ11812是否参与调控人胚胎干细胞干性维持及分化过程。5.研究FLJ11812调控人胚胎干细胞干性维持的分子机制。6.研究ABO以及手性分子R-ABO和S-ABO是否能够诱导小鼠胚胎干细胞向血管内皮细胞分化。7.研究Hmboxl在是否参与的胚胎干细胞向血管内皮细胞的分化过程及其调控的信号通路。研究方法1.我们主要以小鼠胚胎干细胞、人胚胎干细胞和血管内皮细胞为模型,利用ABO和3BDO为研究工具,进行相关研究。2.3BDO靶蛋白的鉴定:2.1利用分子对接的方法分析3BDO与FKBP1A的结合情况。2.2 Western blot检测过表达FKBP1A后,3BDO对MTOR底物的激活情况。2.3使用Western blot、免疫荧光检测3BDO对雷帕霉素引起的效应的拮抗作用。3.检测3BDO对TIA1磷酸化水平的影响:利用免疫沉淀技术结合Western blot检测TIA1中丝氨酸残基的磷酸化水平。4.确定uaRNA FLJ11812能够独立表达:利用Northern blot和实时荧光定量PCR共同确定FLJ11812能够作为一个独立的转录本存在。5.明确TIA1对FLJ11812的加工:5.1利用RNA干扰特异性敲低TIA1后,实时荧光定量PCR检测FLJ11812和TGFB3mRNA水平。5.2利用RNA-CHIP实验检测TIA1与TGFB2 3’UTR的结合关系。6.在人胚胎干细胞中,检测3BDO对FLJ11812水平的影响:6.1实时荧光定量PCR检测3BDO对FLJ11812和TGFB2mRNA水平的影响。6.2利用荧光原位杂交检测3BDO对FLJ11812在细胞内水平及分布的影响。7.检测利用3BDO下调FLJ11812水平后,对人胚胎干细胞干性的影响:实时荧光定量PCR、Western blot和免疫荧光检测FLJ11812降低后人胚胎干细胞中核心转录调控因子(Oct4、Sox2和Nanog)mRNA和蛋白水平的变化。8.利用实时荧光定量PCR检测利用3BDO下调FLJ11812水平后,人胚胎干细胞分化的方向。9.确定FLJ11812与miR-4459结合,以及miR-4459靶点的验证:9.1利用双荧光素酶检测试剂盒检测Luc-FLJ11812-WT和Luc-FLJ11812-A4459与miR-4459共转染后的荧光素酶活性。9.2利用荧光素酶报告基因确定miR-4459的靶基因CDC20B、LARP1和ATG13。10.在人胚胎干细胞中利用3BDO下调FLJ11812水平和转染miR-4459 mimics对miR-4459的靶点和核心转录调控因子的影响。10.1利用Western blot检测下调FLJ11812水平后,人胚胎干细胞中CDC20B、LARP1和ATG13蛋白水平的变化。10.2Westem blot检测利用RNAiMAX转染miR-4459 mimics后,人胚胎干细胞中CDC20B、LARP1、ATG13和Oct4蛋白水平的变化。11.利用流式细胞术、Western blot和免疫荧光检测检测下调FLJ11812之后,细胞周期分布和自噬水平的变化。12.R-ABO诱导小鼠胚胎干细胞向血管内皮细胞分化的检测:12.1通过Western blot和免疫荧光技术检测血管内皮祖细胞标志物CD133和成熟内皮细胞特异标志物(CD31、VE-cadherin、F VⅢ、eNOS和Flk-1)的水平。12.2利用流式细胞术检测R-ABO诱导胚胎干细胞向血管内皮细胞分化的效率。13.利用Matrigel成血管实验和Alexa488-Ac-LDL吞噬实验检测R-ABO诱导的胚胎干细胞来源的血管内皮细胞功能。14.Hmboxl在R-ABO诱导胚胎干细胞向血管内皮细胞分化中的作用:14.1利用Hmboxl特异性的shRNA建立敲低Hmboxl的小鼠胚胎干细胞系。14.2利用Western blot、Matregel成血管实验、Dil-Ac-LDL吞噬实验检测敲低Hmboxl后,R-ABO诱导胚胎干细胞向有功能的血管内皮细胞分化的情况。研究结果1.3BDO通过靶向FKBP1A激活MTOR,使TIA1磷酸化并抑制FLJ11812的水平1.1 3BDO可以与FKBP1A的TYR82侧链羟基H;ILE56的主链的酰胺N形成H键。这两个氨基酸残基也是雷帕霉素与FKBP1A相互作用的位点。FKBP1A过表达可以抑制3BDO引起的MTOR底物RPS6KB1和EIF4EBP1的磷酸化水平。1.2 3BDO预处理细胞30分钟,再用雷帕霉素处理6小时后发现,雷帕霉素的不能抑制磷酸化MTOR和磷酸化RPS6KB1水平。3BDO抑制了雷帕霉素引起的自噬水平的增加。1.3雷帕霉素可以降低TIA1磷酸化水平,而3BDO可以逆转这种效应并上调TIA1磷酸化水平。1.4 3BDO能够抑制3’UTR相关的RNAFLJ11812的表达。1.5 TIA1参与FLJ11812的加工过程。2.FLJ11812调控人胚胎干细胞的干性维持2.1 3BDO可以在人胚胎干细胞中选择性的降低FLJ11812的水平,而不影响TGFB2 的 mRNA 水平。2.2利用3BDO抑制FLJ11812水平之后,胚胎干细胞核心转录调控因子(Oct4、Sox2和Nanog)的mRNA和蛋白水平降低,并引起人胚胎干细胞向三个原始胚层分化。3.FLJ11812 结合 miR-4459,miR-4459 靶向 CDC20B、LARP1 和 ATG133.1在野生型Luc-FLJ11812-WT中,相比于阴性对照组miRNA,10和40 nM miR-4459 mimics转染组的荧光素酶活性分别减少了 20%和40%。而突变了结合位点的Luc-FLJ11812-△4459中,荧光素酶没有降低。确定了 FLJ11812可以与miR-4459结合。3.2将Luc-CDC20B、Luc-LARP1和Luc-ATG13这三种质粒分别与不同浓度miR-4459的mimics共转染到HEK293中,发现荧光素酶的活性与miR-4459 mimics的浓度成正相关的降低。4.FLJ11812作为竞争性内源RNA结合miR-4459并调节其靶基因CDC20B、LARP1 和 ATG134.1在人胚胎干细胞中转染miR-4459 mimics,可以降低miR-4459靶基因CDC20、LARP1和ATG13的蛋白水平,同时也降低核心转录调控因子Oct4的蛋白水平。4.2下调FLJ11812可以引起人胚胎干细胞失去干性维持所必需的胚胎干细胞样细胞周期,并抑制了自噬水平。5.R-ABO高效地诱导小鼠胚胎干细胞向有功能的血管内皮细胞分化5.1我们利用不同浓度的R-ABO处理小鼠胚胎干细胞十天后,R-ABO在10OμM的条件下明显诱导血管内皮细胞标志物CD31蛋白表达。我们利用10 μM的R-ABO诱导胚胎干细胞,发现在第六天和第八天R-ABO明显上调内皮祖细胞标志物CD133的蛋白水平,成熟血管内皮细胞标志物CD31、VE-cadherin、F Ⅷ、eNOS和Flk-1在R-ABO处理组中也明显升高。5.2经过R-ABO诱导的胚胎干细胞在Matrigel上的成血管的能力明显增强,同时也增强了吞噬乙酰化低密度脂蛋白的能力。R-ABO处理组有32.13%的CD31阳性细胞。6.Hmbox1在R-ABO诱导的内皮细胞生成中起重要调控作用6.1 Western blot结果显示只有R-ABO可以上调Hmboxl。6.2利用R-ABO不能够诱导稳定转染了 Hmboxl shRNA的小鼠胚胎干细胞CD133,以及Matrigel上成血管和吞噬Dil-Ac-LDL的能力。6.3经过R-ABO处理,FGF-2蛋白水平在第四天之后明显上调。在敲低Hmboxl的小鼠胚胎干细胞中,R-ABO不能够上调FGF-2的蛋白水平。结论1.3BDO能够直接靶向FKBP1A蛋白并激活MTOR信号通路。2.TIA1参与3’UTR相关的RNA-FLJ11812的加工过程。3.3BDO能够选择性地抑制FLJ11812的水平。4.FLJ11812是人胚胎干细胞的干性维持的重要调控因子。5.FLJ11812可以作为竞争性内源RNA存在,并通过结合miR-4459调控其靶基因(CDC20B、LARP1和ATG13)的表达,从而调控细胞周期、mRNA的稳定性和自噬水平参与人胚胎干细胞的干性维持。6.R-ABO能够高效地诱导小鼠胚胎干细胞向有功能的血管内皮细胞分化。7.Hmboxl蛋白在FGF-2信号通路的上游调控了 R-ABO诱导的胚胎干细胞向血管内皮细胞的分化。