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B型烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)是一种世界性的重要农业害虫,该害虫自20世纪90年代入侵我国以来,已给我国的农业生产和国民经济造成巨大损失。已有的研究表明B型烟粉虱的成功入侵,与该入侵种群对土著昆虫的竞争取代密切相关;B型烟粉虱抗药性的形成在其入侵过程中也起到了重要的作用。本文通过研究与粉虱胁迫耐受性密切相关的热休克蛋白(Hsps),比较了不同生物型烟粉虱之间、B型烟粉虱与近缘种温室白粉虱之间以及对农药抗性和敏感烟粉虱之间胁迫耐受性的差异。探讨了生态适应性在B型烟粉虱成功入侵中的作用。分析了Hsps在生态与进化研究中的应用。本研究的主要内容以及取得的初步成果如下: (1)成功构建了B型烟粉虱热胁迫cDNA文库,未扩增的原始文库容量3.5×10~6,从文库中筛选到的热休克蛋白Hsp70和Hsp90的基因序列含有5’端、ORF和3’端,说明文库的代表性和完整性较好;此外通过用蓝白斑筛选和PCR方法检测噬菌斑内置质粒,表明文库重组率为98.9%,插入片段长度在800bp-2,500bp之间,满足了筛选普通基因cDNA序列的要求,为研究B型烟粉虱与生态适应相关基因奠定了基础。 (2)首次成功克隆出11条编码粉虱Hsps的完整或部分cDNA片段,并递交GenBank,登录号分别为DQ093377、DQ093378、DQ093379、DQ093380、DQ093381、DQ093382、DQ093383、DQ093384、DQ093385、DQ093386和DQ093387。其中有两条完整的cDNA序列,其一为编码Hsp70基因的cDNA序列,该序列全长2207bp,含有1904bp的完整开放阅读框,编码一个644氨基酸的蛋白,计算分子量为70kDa,推导出的氨基酸序列具有70kDa热休克蛋白家族的全部3个签名序列;另一个为编码Hsp90基因的cDNA序列,该序列全长2440bp,含有2163bp的开放阅读框,编码一个721氨基酸的蛋白,计算分子量为83kDa,推导出的氨基酸序列具有90kDa热休克蛋白家族的全部5个签名序列:其余的cDNA片段推导的氨基酸序列均具有部分热休克蛋白家族的签名序列。 (3)成功构建了B型烟粉虱Hsp70和Hsp90的原核表达载体pET21-Hsp70和pET21-Hsp90,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功进行了表达。用IDA树脂对蛋白进行了纯化,免疫兔子制备了高度专一性的抗体。通过Western杂交研究了热休克蛋白表达的时滞性,杂交结果表明:在43℃胁迫30min后的3个小时内,B型烟粉虱的Hsp70蛋白表现为逐渐累积,Hsp90未观察到有明显变化。 (4)建立了检测粉虱Hsps表达差异的实时定量RT-PCR体系。比较和分析了B型与本土China-ZHJ-1型烟粉虱Hsps的胁迫诱导表达情况。在受到4℃、7℃、10℃和13℃的低温胁迫时,B型烟粉虱体内Hsps的诱导表达水平均超过了China-ZHJ-1型烟粉虱,B型Hsp70的最大诱导水平达到8.1倍,而China-ZHJ-1型仅为3.3倍;二者对极端高温的耐受性相似。因此,从对极端温度的耐受能力来看,B型烟粉虱有着较宽的温度生态幅,为关于入侵生物理论的假设提供了有力的实验证据,同时也为B型烟粉虱能在我国南方和北方同时发生猖獗为害,而China-ZHJ-1型的发生范围仅限于南方提供了一些分子生态证据。 (5)运用实时定量RT-PCR体系比较了先后入侵我国的两种粉虱近缘种—B型烟粉虱和温室白粉虱。高温胁迫诱导B型烟粉虱产生Hsps的阈值范围远远超过了温室白粉虱,B型烟粉虱在43℃时仍能大量表达Hsps,而在40℃时,温室白粉虱Hsps的表达水平已降到与未诱导水平相似的程度;在受低温胁迫时,温室白粉虱能在更低的温度(7℃)下产生最大量的Hsps,而B型烟粉虱产生最大量Hsps的温度为10℃。在接受短期冷驯化的锻炼后,二者在检测低温下Hsps的诱导水