近年来,由于毒素-抗毒素(Toxin-antitoxin,TA)系统在细菌和古生菌基因组中大量的广泛存在,然对其生理功能的认识却十分有限,因此引起了越来越多的关注。TA系统最初发现于大肠杆菌低拷贝质粒中,利用一种称为是“分裂后杀伤机制”或“成瘾模块”的机制发挥质粒的稳定性功能。TA系统在影响细菌自身的生长调控、生物被膜的形成、毒力或其他不利条件的应激反应中发挥重要作用。这些模块已经在大肠杆菌和其他各种细菌中被鉴定,但其功能尚需进行深入研究。此外,TA系统存在于猪链球菌(Streptococcus suis)这一重要人兽共患病原菌基因组中,却鲜有报道。尽管目前关于猪链球菌致病性的研究有很多,但对其发病机制的认识仍然非常有限。因此,在本研究中,我们主要开展了猪链球菌2型yefM-yoeB TA系统的鉴定和功能研究,来探讨TA系统与猪链球菌致病性的关系。具体研究内容如下:1.猪链球菌2型毒素-抗毒素系统yefM-yoeB的鉴定生物信息学分析显示猪链球菌2型YefM和YoeB与大肠杆菌、肺炎链球菌的具有极高的同源性,且yefM-yoeB染色体位点存在于猪链球菌的大多数血清型菌株的基因组中。过量产生猪链球菌YoeB毒素会抑制大肠杆菌的生长,并且猪链球菌YoeB毒素的毒性可以被猪链球菌和肺炎链球菌而非大肠杆菌产生的YefM抗毒素中和。更重要的是,将猪链球菌yefM-yoeB系统导入不同种属的大肠杆菌后能影响细胞的正常生长。利用Pull down和Western blot实验证实猪链球菌的毒素蛋白YoeB能与其同源的抗毒素蛋白YefM在体内发生相互作用,并形成稳定的复合物YefM-YoeB。通过β-半乳糖苷酶活性检测实验,表明YefM或YefM-YoeB能够负向自动调节TA操纵子活性,抑制其转录活性。以上结果表明猪链球菌2型中有一对有活性的yefM-yoeB毒素-抗毒素系统。2.缺失yefM-yoeB没有显著影响猪链球菌2型对小鼠的致病性针对目前yefM-yoeB系统模型在细菌致病性方面研究未见深入报道,因此急需进行有关yefM-yoeB影响猪链球菌的生长特性和功能方面的研究。我们利用同源重组的方法成功构建了yoeB毒素基因缺失突变株?yoeB、yefM-yoeB基因缺失突变株?yefM-yoeB和互补菌株C?yefM-yoeB;经多次尝试均未得到敲除yefM抗毒素基因的缺失突变株。突变株?yoeB和?yefM-yoeB较野生株在生长,溶血活性方面没影响。缺失yefM-yoeB不影响猪链球菌2型在小鼠感染模型中的存活或组织定植能力。以上数据表明,猪链球菌yefM-yoeB是一个有活性且与毒力无关的TA系统。3.位于YefM上的Lys64位点改变影响猪链球菌2型的氧化应激反应和致病性利用SWISS-MODEL模拟YefM-YoeB毒素与抗毒蛋白的结构,初步假定其相互作用的关键位点。通过定点突变构建四株假定的抗毒素YefM无活性突变体CΔyefM(A54S)-yoeB、CΔyefM(N58A)-yoeB、CΔyefM(L61A)-yoeB和CΔyefM(K64A)-yoeB。探讨野生株WT、突变株、互补菌株和四株无活性突变体在生长、氧化应激、对小鼠的致病力和细胞毒性的影响。初步研究结果显示CΔyefM(K64A)-yoeB在正常生长、氧化应激、对小鼠的致病力和对hBMEC和HEp-2细胞毒性方面都显著降低;CΔyefM(L61A)-yoeB对HEp-2细胞毒性方面低于野生菌株和互补菌株。结果表明YefM的Lys64位点可能是YefM-YoeB相互作用的关键位点。本研究不仅在猪链球菌2型中首次鉴定了yefM-yoeB系统,同时也丰富了对yefM-yoeB系统的认识。