【背景】胃癌是世界范围内最常见的消化道恶性肿瘤之一,早期诊断及治疗能显著改善胃癌患者的预后。研究发现,肿瘤血管生成在肿瘤的生长、侵袭、转移等过程中发挥着非常重要的作用,早期肿瘤血管表达的异质性分子与肿瘤患者的预后关系密切。目前肿瘤血管诊断的技术手段主要为免疫组化染色进行微血管密度(Micro vessel density,MVD)测定,但其因存在侵入性、过程繁琐等不足,难以实现肿瘤血管的实时定位与在体检测,使其应用受到一定的限制。近年发展的共聚焦激光显微内镜(Confocal Laser Endomicroscopy,CLE)技术,能够在内镜检查的同时显示细胞水平结构,进行实时病理诊断,为实现胃癌血管的活体检测提供了契机。利用特定的技术手段将CLE对比剂与肿瘤血管异质性分子耦联,通过CLE进行肿瘤血管靶向分子成像,有望实现胃癌血管的活体实时检测与动态评估。前期工作中,我们筛选出能与胃癌血管内皮细胞特异性结合的环状短肽GEBP11(具有自主知识产权)并用131I进行标记,制备了同位素探针,成功进行了单光子发射计算机成像(Single photon emission computed tomography,SPECT)、契伦科夫分子成像,证实其具有良好的在体肿瘤血管靶向性和活体成像效果。本课题拟通过制备CLE分子成像探针FITC-GEBP11,进行体外细胞、荷瘤裸鼠及新鲜人体胃癌组织的CLE分子成像,评价FITC-GEBP11短肽探针在胃癌血管靶向CLE分子成像中的效果,探索胃癌血管CLE分子成像新模式,有可能为胃癌血管靶向诊断提供内窥镜分子影像新方法。【目的】1.评价短肽探针FITC-GEBP11在胃癌血管CLE分子成像中的效果;2.探讨靶向胃癌血管的CLE分子成像新模式诊断胃癌的可行性。【方法】1.构建胃癌细胞与内皮细胞共培养模型(Co-HUVECs),制备短肽荧光探针FITC-GEBP11,与Co-HUVECs共孵育后,通过流式细胞技术、免疫细胞荧光及细胞CLE成像,体外检测短肽探针FITC-GEBP11与Co-HUVECs的结合特异性;SGC7901和HUVECs为对照细胞,FITC-URP为对照肽。2.用SGC7901-Luc细胞构建裸鼠皮下及原位荷人胃癌移植瘤模型,应用IVIS成像仪对荷瘤鼠进行生物自发光成像扫描,取肿瘤直径为0.8-1.0cm的裸鼠进行后续实验;通过尾静脉向裸鼠体内注入FITC-GEBP11短肽探针后,进行整体及离体器官荧光信号检测,探索获得最佳成像效果的药物浓度和成像时间。3.在荧光信号最强时间点行活体荷瘤裸鼠肿瘤组织的CLE分子成像,鉴定FITC-GEBP11短肽探针的肿瘤靶向性及CLE活体肿瘤血管靶向成像的效果。4.CLE成像结束后,取裸鼠肿瘤组织迅速进行冰冻切片,通过台式共聚焦激光显微镜观察FITC-GEBP11短肽探针与肿瘤血管的结合情况;将裸鼠肿瘤组织进行HE染色,区分组织类型。5.收集胃癌手术患者的新鲜胃癌组织和对应的癌旁组织,在室温下与FITC-GEBP11短肽探针共孵育30min后,进行CLE分子成像,检测与胃癌血管结合的FITC-GEBP11短肽探针的荧光信号,探索胃癌血管CLE成像的可行性;对照组与FITC-URP短肽共孵育,处理方法相同。6.CLE成像结束后,迅速将人胃癌组织进行冰冻切片,通过台式共聚焦激光显微镜观察FITC-GEBP11短肽探针与胃癌血管的结合情况;将人胃癌组织进行HE染色,区分组织类型。【结果】1.FITC-GEBP11短肽探针的体外生物学活性鉴定1)成功构建了胃癌SGC7901细胞与HUVECs共培养模型(Co-HUVECs);用FITC-GEBP11短肽探针处理细胞后,流式细胞技术显示,在Co-HUVECs中检测到较高的荧光信号,对照细胞和对照肽组信号较低。2)细胞免疫荧光实验及体外细胞CLE结果证实,FITC-GEBP11短肽探针能与Co-HUVECs特异性结合,且主要结合于细胞的胞膜和胞浆,对照细胞HUVECs、SGC7901及对照肽FITC-URP组呈弱结合或不结合。2.FITC-GEBP11短肽探针在荷人胃癌裸鼠中的活体CLE分子成像1)成功构建荷人胃癌裸鼠皮下和原位移植瘤模型,整个实验过程无并发症发生。2)FITC-GEBP11短肽探针以1μg/g体重的用量经尾静脉注入裸鼠体内,观察到在裸鼠肿瘤组织部位有较强的信号聚集,并在24h左右时荧光强信号最强;离体器官荧光成像结果显示,FITC-GEBP11短肽探针能特异性浓聚于裸鼠肿瘤组织;胃肠组织及肝肾组织中观察到较强的荧光信号;对照肽FITC-URP组肿瘤组织部位未检测到特异性的荧光信号。3)在荷人胃癌裸鼠皮下及原位移植瘤模型中,尾静脉注射FITC-GEBP11短肽探针后,CLE在两种动物模型的裸鼠肿瘤组织中都可检测到特异性的荧光信号,对照肽FITC-URP组未检测到特异性的荧光信号。4)将裸鼠肿瘤组织冰冻切片行免疫荧光结果证实,FITC-GEBP11短肽探针能特异性靶向裸鼠肿瘤组织血管;HE染色证实为胃癌组织。3.离体人胃癌组织的血管靶向CLE分子成像1)共收集了28例行胃癌手术切除患者的新鲜胃癌组织和相应的癌旁组织标本;2)新鲜人体胃癌和癌旁组织与FITC-GEBP11短肽探针共孵育后,CLE在胃癌组织中可检测到特异性的荧光信号,癌旁组织和对照肽FITC-URP组无特异性荧光信号;3)人体胃癌和癌旁组织进行冰冻切片后的免疫荧光结果证实,FITC-GEBP11短肽探针能特异性靶向结合于肿瘤组织血管;4)CLE扫描结果:在28例胃癌组织中有26例检测到了特异性的荧光信号(+~+++);而癌旁组织标本有8例仅能观察到较弱的荧光信号(+),另外20例标本未观察到特异的荧光信号(-)。与癌旁组织相比,胃癌组织的CLE分子成像结果具有显著性差异;肿瘤组织分化程度与CLE分子成像半定量结果具有较好的相关性(Spearman r=0.69,P<0.001);利用GEBP11进行CLE分子成像诊断胃癌与HE染色病理组织学诊断结果的一致性较好(Kappa=0.64,95%可信区间:0.35-0.84)。【结论】1.成功制备FITC-GEBP11短肽探针,并进行体外细胞CLE分子成像。成像结果证实,FITC-GEBP11短肽能够特异性结合于Co-HUVECs细胞的胞膜和胞浆,为后续实验提供体外实验依据。2.FITC-GEBP11短肽探针经尾静脉注射入荷瘤裸鼠体内,大体荧光成像显示:GEBP11短肽能特异性浓聚于裸鼠肿瘤组织;通过CLE分子成像能够较好的检测荷瘤裸鼠肿瘤组织的荧光信号。这表明,利用FITC-GEBP11短肽探针进行靶向胃癌血管的活体CLE分子成像具有可行性。3.FITC-GEBP11短肽探针与离体新鲜人胃癌组织孵育后,能特异性结合于肿瘤组织血管;通过CLE分子成像检测到特异结合于胃癌血管的高荧光信号,能够区别胃癌与癌旁组织,且组织分化程度越低,GEBP11阳性率越高。胃粘膜局部应用短肽荧光探针进行靶向胃癌血管的CLE分子成像,有可能成为一种诊断胃癌的影像学新方法。