论文部分内容阅读
本课题组从长白山白眉蝮蛇(Gloydius ussurensis)毒素中分离得到磷脂酶A2的同源物，质谱检测分子量为13880.789kDa，等电聚焦测定其pI值约为8.56，并将其命名为Gln49-磷脂酶A2(简称GIn49-PLA2)。GIn49-PLA2具有神经毒性、肌肉毒性、细胞毒性和丝氨酸蛋白酶的类凝血酶活性，但检测不到水解磷脂酰胆碱的催化活性；该酶含有14个Cys残基，能够形成七对二硫键，是研究蛋白质结构与功能良好的素材。通过基因亚克隆和PCR定点突变，使得GIn49-PLA2及其突变体Lys49-PLA2、Asp49-PLA2基因在pET-32a(+)载体上以包涵体形式进行融合表达，但是结果并不理想。本论文工作的目的是通过基因亚克隆和PCR定点突变的手段，在pMALc2x载体上实现PLA2及其多个突变体基因的可溶高效表达。
利用PCR技术亚克隆GIn49-PLA2基因，采用重叠延伸PCK技术定点突变获得突变体Asp49-PLA2、Lys49-PLA2等基因，构建pMAL-Asp49-PLA2、pMAL-Lys49-PLA2重组融合表达质粒；将其转化到大肠杆菌中，双酶切后电泳检测，对重组DNA测序，获得阳性克隆。将构建好的重组质粒转化到大肠杆菌TB1中，通过SDS-PAGE对诱导前和诱导后的蛋白检测，验证了fmAsp-PLA2确实以可溶形式表达。通过对诱导温度和诱导时间的优化，确定了TB1在37℃，培养到OD600约为0.4时，加入终浓度为0.5mMIPTG，诱导4h，可获得高效可溶表达的融合蛋白。随后，采用一步亲和层析、阴离子交换层析从细胞裂解液中获得纯度较高的fmAsp49-PLA2；用蛋白水解酶Factor Xa体外切除融合标签MBP，电泳结果显示酶切后产生大约40kDa和14kDa的两部分蛋白，证明融合蛋白表达正确；优化的酶切条件为：温度，4℃；fmAsp49-PLA2浓度，0。8mg蛋白/ml；酶切时间，12h。酶切后采用阳离子交换层析、肝素层析和凝胶层析仍然无法将目的蛋白与融合标签分离。对fmAsp49-PLA2和fGln49-PLA2的水解活性与凝血活性进行检测，发现二者都较低。