论文部分内容阅读
第一部分淫羊藿苷促进关节软骨细胞增殖和表型维持目的：证明淫羊藿苷具有促进大鼠关节软骨细胞增殖和表型维持的作用。方法：用CCK8法和流式细胞术测定淫羊藿苷对关节软骨细胞增殖的影响；用RT-qPCR、Western Blot、免疫荧光的方法检测淫羊藿苷对增殖基因(PCNA、Ki67和CyclinD1)表达的影响；用RT-qPCR检测淫羊藿苷对软骨特征基因(SOX9、OL2和Aggrecan)表达的影响。结果：在淫羊藿苷作用下,细胞增殖能力得到加强,并且PCNA、Ki67、CyclinD1、 SOX9、COL2和Aggrecan的表达增加。结论：淫羊藿苷能有效促进关节软骨细胞增殖,并通过上调SOX9、COL2和Aggrecan的表达来维持关节软骨表型。第二部分YAP在淫羊藿苷促进关节软骨细胞增殖中的作用目的：研究YAP蛋白在淫羊藿苷促进关节软骨细胞增殖中的作用。方法：通过RT-qPCR和Western Blot的方法检测淫羊藿苷对YAP及其目的基因Ankrdl和CTGF表达的影响；用shRNA沉默YAP,通过RT-qPCR和Western Blot的方法检测Ankrdl、CTGF、PCNA、Ki67和CyclinDl的表达情况,以及沉默YAP后再用淫羊藿苷干预时,上述基因的表达情况。在体内实验中,用免疫组化的方法检测口服淫羊藿苷(每天2mg持续30天)对大鼠关节软骨中YAP和CTGF表达的影响：结果：在体外实验中,淫羊藿苷能促进YAP、Ankrdl和CTGF的表达;YAP沉默后,Ankrdl、CTGF、PCNA、Ki67和CyclinD1的表达下调,此时淫羊藿苷不再促进这些基因的表达。在体内实验中,淫羊藿苷可促进关节软骨中YAP和CTGF的表达。结论：淫羊藿苷通过YAP促进关节软骨细胞增殖,通过口服淫羊藿苷可以在关节软骨局部产生有效的药物浓度。第三部分淫羊藿苷影响YAP磷酸化修饰的分子机制目的：研究淫羊藿苷影响YAP磷酸化修饰的分子机制以及F-actin与Hippo通路调控YAP活性时的相互关系。方法：淫羊藿苷作用细胞后,用Western Blot方法检测p-YAP、p-MYPT和p-Cofilin的水平以及用免疫荧光方法检测YAP蛋白的细胞内定位情况,来观察YAP蛋白和ROCK通路的活性状态。用拉春库林B作用细胞1小时以及先用淫羊藿苷预处理3天再用拉春库林B作用细胞1小时,通过Western Blot方法检测p-YAP的水平以及通过免疫荧光的方法来观察F-actin的形态,以判断F-acin是否为淫羊藿苷影响YAP蛋白磷酸化修饰的唯一靶点；通过等重同位素多标签相对定量(iTRAQ)蛋白质组学来寻找淫羊藿苷影响YAP磷酸化修饰的新机制。结果：淫羊藿苷抑制YAP蛋白磷酸化并促进其进入细胞核：促进MYPT和Cofilin蛋白磷酸化；虽不能阻止拉春库林B解聚F-action但它能抑制F-actin解聚后引起的YAP蛋白磷酸化。此外,它还能降低SAV1和p-Mob蛋白的含量。结论：淫羊藿苷通过上调ROCK通路活性并促进F-actin的合成以及抑制Hippo通路活性来激活YAP蛋白的活性。此外,F-actin是Hippo通路上游的调控成分。