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目的将粪肠球菌法和芽孢法两种模拟污染物实验室评价方法,运用于管腔型器械清洗效果评价,比较二者的一致性、重复性和稳定性;建立体外生物膜生成模型,将细菌生物膜引入实验室清洗效果评价,为制定我国管腔型器械清洗效果评价方法提供实验参考和数据支持。方法1.用粪肠球菌法和芽孢法,评价清洗液和水的清洗效果,通过比较除菌对数值(RF)、变异系数(CV)和95%可信区间(95%CI),分析两种方法用于清洗效果评价时的重复性和稳定性。2.根据肉眼观察4种标准菌株培养24h后细胞板中膜状物生成情况,选择生物膜培养用菌;用普通光学显微镜(OM)、菌落计数法,确定成熟生物膜培养时间。根据试验结果建立培养模型:含铜绿假单胞菌的肉汤培养基于测试管(Teflon、PVC)内以10mL/min流速每日持续流动4h,连续培养6天后,形成成熟生物膜。3.分别用两种清洗方式(清洗液、水)和两种清洗消毒方式(清洗液+OPA、水+OPA)处理附着有成熟生物膜的测试管(Teflon、PVC),利用普通光学显微镜(OM)、扫描电子显微镜(SEM)和菌落计数法,定性定量评价以上四种方法处理生物膜的效果。4.用载体定量杀菌试验和肉汤培养法,对比分析0.55%邻苯二甲醛作用于浮游细菌和生物膜细菌的区别。结果1.评价清洗液清洗效果,粪肠球菌法RF为4.07,芽孢法RF为4.83,二者差异有统计学意义(p＜0.05);评价水清洗效果,粪肠球菌法和芽孢法RF分别为2.57、2.22,且差异无统计学意义(p＞0.05)。在评价清洗液清洗效果时,粪肠球菌法CV为0.247,95%CI(3.64,4.49),芽孢法为CV 0.117,95%CI(4.58,5.07);评价水清洗效果时,粪肠球菌法CV为0.334,95%CI(2.24,2.91),芽孢法CV为0.299,95%CI(1.94,2.47)。2.培养6天后铜绿假单胞菌生物膜管壁粘附稳定性好,细菌浓度达10~7cfu/cm~2,结晶紫染色OM观察可见,生物膜厚度均匀,且不易被成片冲脱。3.清洗效果评价中,“水洗”和“清洗液清洗”处理附着生物膜的Teflon测试管残留菌落平均对数值分别为6.16和6.32,差异无统计学意义(p＞0.05);清洗消毒效果评价中,残留菌落平均对数值分别为0.77和0.59,二者差异无统计学意义(p＞0.05)。SEM观察可见“清洗液清洗”组残细菌胞外基质较少;“水+OPA”组残留生物膜细菌多于“清洗液+OPA”组。SEM观察结果和菌落计数结果不一致。PVC管生物膜处理结果与Teflon管类似。4.附着浮游铜绿假单胞菌测试管,于0.55%OPA浸泡1min,细菌杀灭率达100%;附着铜绿假单胞菌生物膜测试管,于0.55%OPA浸泡7min,仍有53.8%(14/26)测试管上可回收活菌(10cfu/管～60cfu/管),另将活菌检测呈阴性的测试管置入营养肉汤中,37℃培养24h后,25%(3/12)试管肉汤呈浑浊状。结论1.粪肠球菌法和芽孢法评价管腔清洗效果结果并不完全一致。芽孢法的稳定性较粪肠球菌法好,且用于清洗效果评价同样具有代表性,但染菌浓度需增加,测试管长度代表性还需进一步实验证实。2.培养6天的铜绿假单胞菌生物膜在测试管内分布均匀,不易被成片冲脱,可用于清洗效果评价。3.清洗液去除细菌胞外基质效果优于水;清洗消毒处理后,残留的生物膜细菌多为无活性死菌;相比水洗处理,清洗液处理更有利于后续消毒程序进一步去除细菌生物膜。4.铜绿假单胞生物膜细菌比浮游菌对消毒剂(0.55%OPA)具有更强的耐受性。