螺原体(spiroplasma)是一类基本形态为螺旋状、无细胞壁的原核微生物,也是原核生物中能独立生活和自我复制的最简单的生命形式,它的基因组非常小(780-2220kb)。螺原体没有细胞壁和鞭毛,仅靠单层膜包裹整个细胞,常作为研究运动的模式生物。中国有关螺原体的研究非常少,研究力量十分薄弱,调查我国昆虫螺原体的存在情况,收集昆虫螺原体资源,将有助于充分认识和利用这类重要的微生物资源。本研究于2009年在我国5个省,特别是南京地区采集300多种不同种类的昆虫进行螺原体分离,结果主要在膜翅目蜜蜂总科和蛛蜂总科的昆虫中分离到8株螺原体,分别是MUF0901分离自木蜂、STF0901和STF0902分离自四条蜂、QYF0901分离自切叶蜂、ZHUF0901分离自蛛蜂、MF0903、MF0904和MF0905均分离自蜜蜂。之后对分离菌株进行形态学、基本生物学、分子生物学及血清学特性的研究,已初步确定分离菌株的分类地位。此外,还对我国部分螺原体资源进行遗传多样性分析,以期调查我国螺原体资源的丰富度。应用暗视野显微镜和透射电子显微镜观察螺原体形态,并对分离菌株的运动性、基本生物学特性及致病性进行研究。结果发现分离菌株在R2液体培养基中都生长良好,并呈翻滚式运动,能通过孔径为0.22μm、0.45μm的微孔滤膜；分离菌株在对数生长期都呈典型的螺旋状；在固体培养基上都呈圆形或颗粒状菌落,有些可见卫星菌落；都能利用葡萄糖、D-果糖作为碳源；代谢精氨酸的能力稍有差异；都不能利用尿素,在含氨苄青霉素钠(2000U/m1)的R2液体培养基中都生长良好；毛地黄皂苷能抑制这些菌株的生长,产生较大的抑菌圈,以上这些特征说明分离菌株均符合Spiroplasma属的描述。在最适生长温度下,所有菌株的生长曲线都分为延滞期、对数期、稳定期、衰亡期4个典型的生长阶段,但它们的生长速度有所不同；除菌株MF0905外所有分离菌株的生长pH范围比较宽泛,最适pH一般是7.2或7.6。经基本生物学研究发现分离菌株MF0905、ZHUF0901明显区别于其它6株菌。通过饲喂新鲜菌液接种法研究了2株特殊螺原体MF0905、ZHUF0901对意蜂(Apis mellifera)的致病性,发现感染菌株ZHUF0901的意蜂(Apis mellifera)在第6d出现类似“爬蜂病”症状,A. mellifera校正死亡率为26.15%,与对照(接种培养基)相比达到5%水平显著差异。而感染菌株MF0905的A. mellifera校正死亡率仅为2.25%,在饲喂过程中也没有发现典型的“爬蜂病”症状,在5%显著水平下与对照(接种培养基)相比差异不显著。推断分离自蛛蜂的菌株ZHUF0901对意蜂具有较强的致病性,而分离自意蜂的菌株MF0905对意蜂的致病力较弱。采用细菌试剂盒提取螺原体DNA,然后对16SrDNA、ITS、rpoB、parE、spiralin等5个基因进行PCR扩增并测序,之后结合其它已报道的螺原体属内所有的种进行系统发育分析。结果表明spiralin基因可能不适合作为一个遗传marker在种水平上进行螺原体分类鉴定；基于16S rDNA、ITS、rpoB、parE等序列构建的系统发育树显示ZHUF0901与S. apis聚为一枝；MF0905与S. clarkii聚成一类；其它6株菌都与Spiroplasma melliferum聚类,它们的自展值都很高,因此推断ZHUF0901可能是S.apis,MF0905可能是S. clarkii,其它6株菌STF0901、QYF0901、MUF0901、MF0903、 STF0902、MF0904都属于S. melliferum,但需要用血清学试验进一步证明。通过免疫新西兰大白兔获得了ZHUF0901、MF0905多克隆抗体,利用实验室已有的抗体及新制备的抗体,对分离的8株螺原体分别进行了生长抑制试验、代谢抑制试验、菌体变形试验。3个血清学试验结果一致表明：在用已知的S. melliferum抗体与分离菌株反应时,ZHUF0901、MF0905表现弱反应,而其它6株菌则表现较强的反应；在用ZHUF0901、MF0905抗体进行交叉互补试验时,这2株螺原体都只分别与自身的抗体表现较强的特异性反应并产生较大的抑菌圈,而与其它菌株的抗体反应较弱。以上结果表明,菌株MUF0901、STF0901、STF0902、QYF0901、MF0903、MF0904与S. melliferum亲缘关系较近,属于S. melliferum类群,而ZHUF0901、MF0905不属于S. melliferum.蜜蜂螺原体是蜜蜂螺原体病(spiroplasmosis)的致病菌,也是蜜蜂爬蜂病的主要病原之一。本研究以蜜蜂螺原体标准菌株S. melliferum CH-1作为包被抗原,建立了S. melliferum CH-1的间接ELISA(酶联免疫吸附分析)检测方法。利用建立的ELISA标准化程序对分离菌株进行了分类鉴定,结果显示ELISA方法与上述传统的血清学方法所得结果一致,而且结果更加准确、具体。此方法的建立也为今后蜜蜂螺原体快速检测技术的实际应用奠定了基础。采用随机扩增多态DNA(RAPD)技术,对实验室20株昆虫及植物花螺原体的分类、宿主种类、菌株之间的遗传多样性进行了分析。从40条随机引物中筛选出34条引物,共扩增出5301条条带,其中4954条表现出多态性,多态性条带占93.45%。根据螺原体个体间的相似性,用UPGMA法聚类分析。结果表明,分离菌株在60%相似性水平上可聚类分为5个分枝,其中A1分枝包括5个菌株,除1株分离自昆虫外其余4株都分离自植物花；A3分枝主要包括的是膜翅目昆虫螺原体；A4分枝包括了3个目的昆虫螺原体；B、c都仅包括一个菌株。以上结果初步说明我国螺原体的遗传多样性丰富。本研究通过对8株昆虫螺原体进行形态学、基本生物学、分子生物学以及血清学特性等方面的研究。初步推断分离自蛛蜂的ZHUF0901可能是Spiroplasma apis,分离自蜜蜂的MF0905可能是Spiroplasma clarkii,其它6株菌属于Spiroplasma mellifenim。这是首次在我国发现S. apis,也是首次在我国蜜蜂体内分离到Spiroplasma melliferum以外的螺原体菌株,这些菌株的发现为我国蜜蜂螺原体病的研究提供了重要的信息。采用RAPD技术,对实验室20株昆虫及植物花螺原体的分类、宿主种类、菌株之间的遗传多样性进行了分析,结果初步反应了我国具有丰富的螺原体资源且遗传多样性丰富。