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鸡传染性支气管炎(Avian infectious bronchitis, IB)是由传染性支气管炎病毒(Ⅰnfectious bronchitis virus, IBV)起的鸡的一种急性、高度接触性、病毒性传染病。N基因在进化上相对保守,N蛋白是决定IBV抗原性的主要结构蛋白,可参与结合病毒的RNA,诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。因此,研究N蛋向的生物学功能及特性对IB的诊断和防治具有重要的意义。通过诱导表达高度保守性的N蛋白,并利用其作为包被抗原,建立IBV抗体间接ELISA检测方法,为鸡群IBV抗体的监测、诊断和防制该病提供可靠的理论依据和有效的技术支持。本试验根据NCBI发表的IBV基因序列设计了一对针对N基因完整开放阅读框的引物,利用RT-PCR方法扩增出1750bp的目的条带,之后将目的片段连接pMD18-T克隆载体中经测序证实N基因扩增正确后,再根据已测序获得的N基因序列设计一对亚克隆引物,利用PCR方法扩增获得1230bp的目的片段,并将其插入到pET-30a(+)表达载体中,构建重组质粒pET-30a-N,经酶切、测序鉴定正确后转入到大肠杆菌Rossetta惑受态细胞中,利用IPTG进行诱导表达,获得大小为51kDa的可溶性N蛋白。VVestern-blot检测重组蛋白,能与1BV阳性血清很好的反应性,表明所表达的N蛋向具有很好的生物活性。将pET-30a-N重组蛋白经镍柱纯化后作为包被抗原,建立IBV抗体间接ELISA检测方法,并对所建立的间接ELISA方法的工作条件进行优化。结果表明,抗原的最佳包被浓度为2.5μg·mL-1,血清的最佳稀释度为1：40,最佳封闭液为1%BSA,最佳封闭时间为2h,二抗最佳稀释度为1：1000,最佳底物显色时间为10min。重复性试验和特异性试验结果表明,建立的间接ELISA检测方法具有很好的重复性和特异性,与禽白血病病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、大肠杆菌、沙门氏菌等阳性血清均无交义反应。采用建立的间接ELISA方法检测135份临床血清样本,与病毒作为包被抗原ELISA检测的结果有很高的符合率,为IB的快速诊断及流行病学研究提供了一个很好的工具。