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药源性聋是指由药物耳毒性引起的前庭和耳蜗尤其是内耳感觉毛细胞的损伤而导致的听功能障碍。虽然WHO发布的药物清单中有很多药物可挽救生命,但其中有些药物具有耳毒性副作用,如氨基糖苷类抗生素和铂类药物。目前,FDA尚未批准任何相关防治耳毒性药物,虽然现阶段已经有预防和治疗药源性聋的药物进入临床前或临床研究阶段,但是对于药物防治耳毒性的作用机理还未明确。因此,本课题主要评估载姜黄素(curcumin,CUR)的纳米粒(nanoparticles;NPs)是否具有防治顺铂(cisplatin,CDDP)耳毒性的作用。该纳米粒是以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)作为载体材料,壳聚糖(chitosan,CS)进行表面修饰,以CUR作为包载药物形成CUR-CS/PLGA NPs和CUR-PLGA NPs两种纳米粒。同时,我们还评估了由地塞米松(dexamethasone,Dex)与丹酚酸B(salvianolic acid B,Sal B)结合形成的药-药缀合物DoNB和DdNB,以及分别由它们自组装形成的DoNB NPs和DdNB NPs是否可拮抗CDDP所致的耳毒性,同时探索这些药物的作用机制。采用复乳法制备CS/PLGA NPs和PLGA NPs两种纳米粒,并对这两种纳米粒的基本性质进行表征,如粒径、电荷等。体外释放规律考察发现CUR-PLGA NPs和CUR-CS/PLGA NPs的药物释放行为非常一致,游离CUR于24小时内药物累计释放量几乎达到稳定,而这两种载药纳米粒在120小时内才基本达到稳定,这说明CUR-PLGA NPs和CUR-CS/PLGA NPs均具有缓释性能。然后,比较了这带两种不同电荷纳米粒在HEI-OC1细胞(源自于耳蜗毛细胞)中的细胞摄取及其在内耳组织中的分布情况,结果显示,在1小时时,带正电荷的CUR-CS/PLGA NPs在HEI-OC1细胞胞内的荧光强度明显增强,且CUR-CS/PLGA NPs组在内耳各组织中的荧光强度显著高于CURPLGA NPs组和CUR组,表明CS有助于纳米粒被摄取入细胞内。为了进一步确定CUR-NPs是否具有防治CDDP耳毒性的作用,本课题还建立了CDDP所致体内外感觉毛细胞损伤模型。采用MTT法考察CUR-NPs对CDDP所致HEI-OC1细胞损伤模型的防护作用,结果显示,CUR-NPs均可不同程度地预防和保护HEI-OC1细胞免受CDDP的毒副作用。同时,还考察了CUR-PLGA NPs和CURCS/PLGA NPs对CDDP所致豚鼠耳聋模型的听力阈值、内耳毛细胞存活以及内耳组织中Caspase-3受体表达的影响,结果显示,无论是采取预防还是治疗手段,CUR-PLGA NPs和CUR-CS/PLGA NPs均可显著降低CDDP所致豚鼠耳聋模型的听力阈值,保护豚鼠内耳毛细胞免受CDDP的耳毒性作用。另外,实验结果显示,CUR-PLGA NPs和CUR-CS/PLGA NPs可能通过调节耳蜗组织中Caspase-3受体的表达情况,起到保护内耳毛细胞的作用。药-药缀合物DdNB和DoNB是本课题组前期制备的两种药物,它们通过自组装分别形成了DdNB NPs和Do NB NPs。前期研究发现,这两种药-药缀合物及其纳米粒均可减轻CDDP对HEI-OC1细胞的毒副作用。为了确认这两种药-药缀合物及其纳米粒在动物模型中是否具有保护内耳毛细胞的能力,在本研究中,考察了这几种药物经局部或全身给药后对CDDP的耳毒性的预防作用。结果显示,在CDDP所致豚鼠耳聋模型中,经局部给药后,不同浓度的药-药缀合物及其纳米粒对内耳毛细胞的保护作用不尽相同。免疫组织化学试验显示,药-药缀合物及其纳米粒可能是通过调节内耳组织中糖皮质激素受体的表达起到保护作用。另外,也考察了它们经全身给药后对CDDP所致豚鼠耳聋模型内耳毛细胞的影响,结果显示,这些药物经全身给药后的效果略差于局部给药的效果,但也具有保护作用。在前期的工作中,药-药缀合物及其纳米粒已被证明它们经内耳递药后具有良好的生物相容性。为了考察PLGA NPs和CS/PLGA NPs的生物相容性,本研究主要以HEI-OC1细胞为体外模型和豚鼠为体内模型,分别考察这些药物的细胞相容性和生物组织相容性。结果显示,从0.05至5 mg/mL的CS/PLGA NPs与HEI-OC1细胞作用24或48 h后,HEI-OC1细胞的存活率分别102%～107%和100%～83%;浓度范围为0.05至5 mg/mL的PLGA NPs与细胞作用24或48 h后,HEI-OC1细胞的存活率分别102%～86%和100%～80%,说明CS/PLGA NPs和PLGA NPs对HEI-OC1细胞没有明显的毒性。本课题组前期工作已证实药-药缀合物及其纳米粒的细胞生物相容性良好。并以豚鼠为实验对象,通过HE染色考察不同特性药物用于内耳递药的安全性,结果均显示,这些药物与耳蜗组织有着良好的生物相容性。综上所述,本课题考察的CUR-NPs具有防治CDDP所致耳毒性的潜力,其中,表面修饰正电荷的CUR-CS/PLGA NPs的作用效果更优。同时,本课题组制备的药-药缀合物及其纳米粒经局部或全身给药后均具有不同程度的防护作用,这些药物可能为药源性聋的防治奠定了基础。