背景和目的:高血压是一种多基因遗传和多种环境因素共同作用下的复杂疾病,是脑卒中、冠心病和心肾功能衰竭的主要原因。目前在我国高血压主要为原发性高血压,即多种环境和遗传因素介导的原因不明的血压升高。高血压的发生机制包括神经内分泌机制、肾脏功能改变、血管功能紊乱、细胞膜离子转运异常等,其中组织离子稳态失衡尤其是钙信号的调控异常在原发性高血压的发生中发挥重要作用,因此通过探究高血压发生过程中相关阳离子通道的功能变化有助于高血压的防控。钙离子(Ca2+)是血管平滑肌细胞内重要的信使物质之一,参与调控血管平滑肌收缩、细胞增殖等并在高血压中发挥重要作用。细胞内Ca2+不仅能直接促进血管收缩,还能够作为细胞内重要的第二信使在调控细胞信号转导发挥重要作用。近年研究发现一类新的离子通道——瞬时受体电位通道(Transient Receptor Potential Channel,TRP)在心血管代谢疾病中发挥重要作用。TRP通道是一类对钠、钙等阳离子通透的非选择性阳离子通道,它分为TRPCs,TRPVs及TRPMs等亚型,其中TRPC3作为TRPCs亚家族中的一员在心血管疾病中的作用备受关注,研究证实TRPC3主要分布于大脑中兴奋性和非兴奋性神经元、感觉神经元、心肌组织、肺组织、气道平滑肌、垂体和血管平滑肌及内皮组织等。目前关于TRPC3在高血压中的作用研究较少,我们前期的研究证实TRPC3通过调控血管平滑肌钙离子进而影响血管功能和血压,并首次在国际上报道了TRPC3在自发性高血压大鼠(SHR)主动脉平滑肌组织及细胞中表达增强,且介导细胞钙内流增加与血管收缩反应及血管振荡运动增强有关,抑制血管组织TRPC3可抑制SHR肠系膜动脉的血管振荡运动。Ca2+是ROS产生的重要调节物,Ca2+信号和ROS间存在一种功能性的串话。线粒体是最早被认识的钙库,线粒体外膜对Ca2+有较好的通透性,而内膜的高度选择通透性在维持线粒体膜电位和氧化磷酸化中发挥着重要的作用。线粒体内过低的Ca2+浓度导致ATP生成减少,而过高的线粒体Ca2+浓度所引发的Ca2+超载则导致ROS生成过多。线粒体Ca2+和线粒体ROS与高血压的发生密切相关,研究证实高血压时细胞能量状态低下,且过度生成的ROS能够通过转录和翻译后调控细胞膜、线粒体及肌浆网上的L型钙离子通道及钙库操纵的钙内流(Store Operate Calcium Entry,SOCE)的相关分子,进而能够直接影响血管功能。最近也有研究表明TRPC3也表达于成纤维细胞线粒体内膜上,参与调控线粒体Ca2+稳态。目前对血管平滑肌细胞线粒体TRPC3表达及作用研究尚缺乏,尤其是高血压时血管平滑肌细胞线粒体TRPC3表达及功能是否发生改变,调控线粒体TRPC3是否影响线粒体钙摄取及线粒体功能进而影响血管功能,亟需进一步深入研究。血管紧张素II在高血压及相关心血管疾病发生中起重要作用,除直接作用于AT1R,血管紧张素II可作用于其他受体进而对细胞的功能发挥调控作用。研究认为线粒体上可能存在血管紧张素II的受体,进而对线粒体功能发挥直接的调控作用。我们前期研究证实TRPC3参与高血压的发生,血管紧张素II能够上调血管平滑肌细胞TRPC3的表达并促进平滑肌细胞的钙内流增加,而替米沙坦干预能够部分逆转血管紧张素II的作用。但血管紧张素II和替米沙坦能否通过影响血管平滑肌线粒体TRPC3和线粒体钙摄取,调控线粒体ROS生成改善血管平滑肌细胞收缩功能和血压,有待进一步深入阐明。本研究包括三个部分:1.TRPC3在血管平滑肌细胞线粒体中的表达及功能。2.TRPC3调控血管平滑肌细胞线粒体功能对ROS生成和血管收缩的作用。3.长期替米沙坦干预抑制血管线粒体TRPC3对血压和血管功能的作用及机制,分别观察TRPC3在血管紧张素II诱导的高血压中的作用及长期替米沙坦干预对血管平滑肌线粒体TRPC3及SHR血压和血管功能的作用及分子机制。我们通过SHR及其正常对照WKY大鼠和TRPC3-/-基因敲除小鼠,结合原代培养的主动脉平滑肌细胞,明确线粒体TRPC3通过调控线粒体钙摄取和线粒体ROS生成在高血压中的作用,同时在整体水平利用替米沙坦进行干预以明确能否通过作用于线粒体TRPC3和线粒体钙稳态进而改善血管功能及高血压。材料和方法:整个研究包括离体实验和在体实验。前两部分以SHR及WKY大鼠原代培养的主动脉平滑肌细胞为主要研究对象,明确线粒体TRPC3的表达及功能,阐明线粒体TRPC3在调控SHR血管平滑肌线粒体功能及血管收缩中的作用。第三部分在体实验,用TRPC3-/-小鼠及其同窝野生型小鼠作对照,给予血管紧张素II灌注制造高血压模型,明确TRPC3在血管紧张素II介导的血管平滑肌线粒体功能紊乱和血管收缩反应增强中的作用;第四部分通过观察长期替米沙坦干预对SHR及正常血压WKY大鼠的作用,明确长期替米沙坦干预对血管平滑肌线粒体TRPC3的作用及改善血管线粒体功能和血管收缩功能及血压的影响。实验主要方法如下:1.无创鼠尾血压和植入子血压遥测技术明确WKY、SHR及TRPC3-/-小鼠在不同干预条件下鼠尾及24h动态血压的变化情况;2.小血管张力实验明确SHR及TRPC3-/-小鼠肠系膜动脉对不同干预因素下肠系膜动脉收缩及舒张功能的变化情况;3.采用荧光比率仪和全波长酶标仪明确上述干预因素对血管组织、血管平滑肌细胞的细胞水平和线粒体水平钙摄取情况;4.qPCR、免疫印迹和免疫荧光实验检测TRPC3、丙酮酸脱氢酶、Rho A/Rho kinase通路相关蛋白的表达及分布;5.高分辨率线粒体呼吸功能测定及其他氧化还原指标测定明确上述因素对血管平滑肌细胞及组织线粒体呼吸功能、ATP生成及ROS生成等指标的影响;结果:1.TRPC3表达于血管平滑肌细胞线粒体中,SHR血管平滑肌细胞线粒体TRPC3表达增强,其介导的线粒体的[Ca2+]m摄取增加。替米沙坦能抑制SHR血管平滑肌线粒体TRPC3表达及线粒体钙摄取。2.SHR血管平滑肌线粒体TRPC3表达增强,促进线粒体ROS生成,抑制ATP合成及线粒体呼吸功能,进而导致SHR血管收缩功能增强。TRPC3抑制剂Pyr3或替米沙坦干预能够通过抑制TRPC3部分逆转上述病理改变。3.TRPC3基因敲除削弱血管紧张素II诱导的高血压。以TRPC3-/-小鼠及其同窝野生型WT小鼠为观察对象,给予血管紧张素II灌注14天,发现TRPC3-/-可削弱血管紧张素II介导的血管收缩反应增强和血压升高的作用。4.TRPC3-/-能够部分改善血管紧张素II介导的线粒体钙超载、PDH抑制及线粒体功能受损;TRPC3-/-可抑制血管紧张素II介导的RhoA/Rho kinase激活及ROS生成。5.替米沙坦干预SHR能抑制血管平滑肌线粒体TRPC3通过改善线粒体功能、减少ROS生成和血管收缩功能,进而改善高血压。结论:1.TRPC3在血管平滑肌细胞线粒体中有表达,抑制血管线粒体TRPC3能减少血管平滑肌细胞线粒体钙摄取。2.高血压时血管线粒体TRPC3表达增强,促进血管平滑肌细胞线粒体钙摄取、ROS生成增加,促进血管收缩,提示血管平滑肌线粒体TRPC3参与高血压发生。3.TRPC3基因敲除能够部分抑制血管紧张素II介导的线粒体钙摄取,改善血管功能及降低血压。4.替米沙坦干预能抑制血管平滑肌线粒体TRPC3表达,改善血管线粒体功能和降低血压。提示替米沙坦抑制血管线粒体TRPC3是其改善血管功能、防治高血压的机制之一。