Pseudomonas mosselii E1和P.pseudoalcaligenes B50铁载体合成相关基因的克隆及功能初步分析

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:frankyfeng
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从棉花根际筛选到铁载体产生细菌B50和E1。通过形态观察、生理生化鉴定,B50和E1都是革兰氏阴性无芽孢杆菌,属于假单胞菌属,16SrDNA测序结果表明,B50的16S rDNA序列与Pseudomonaspseudoalcaligenes的同源性为100%,E1的16S rEINA序列与Pseudomonasmosselii的同源性为100%。用抗生素平板法对P.pseudoalcaligenes B50和P.mosselii E1进行药敏试验,B50和E1都对卡那霉素敏感,能够耐受10μg/mL以上的氯霉素。 利用转座子Tn5-1063a分别对E1和B50进行转座子插入诱变,筛选出2株E1铁载体合成缺失突变株:E1-185和E1-332;5株B50铁载体合成缺失突变株:B50-472、B50-982、B50-1358、B50-1657和B50-1723。根据转座子Tn5-1063a当中的luxA序列设计引物,分别以E1和B50总DNA、pRL1063a质粒DNA和突变株总DNA进行PCR扩增,测序,与已知的luxA序列进行比对,铁载体合成缺失突变株的luxA序列均与已知的luxA序列同源性为100%,由此证实转座子确实插入到E1和B50的基因组中。 根据转座子Tn5-1063a两端的序列分别设计3个嵌套引物,同时设计了7个随机引物,用TAIL-PCR(Thermal asymmetric inter laced PCR)方法,从突变株E1-185中克隆到铁载体合成相关基因cysI。cysI与半胱氨酸合成有关,在非核糖体肽类型的铁载体合成过程中,参与酰基硫载体蛋白(acyl-S-PCPs)的合成,是铁载体合成过程中的关键步骤,并进行了验证试验。 从突变株B50.1657中克隆到铁载体合成相关基因pyrD。pyrD编码二氢乳清酸脱氢酶,催化S-二氢乳清酸到乳清酸的转化,是嘧啶合成的第四步。通过试验证实,pyrD与铁载体的合成有关。 此外,还从突变株B50-1358中克隆到铁载体合成相关基因relA的部分序列。relA编码严谨控制因子RelA/SpoT,调控(p)ppGpp的合成和水解。严谨控制是细菌在营养贫瘠的环境下生长时产生的一种应激反应,培养基中有效铁含量的不足引起细菌的严谨控制反应,诱发铁载体的产生。
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