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目的:乳腺癌是女性易患的恶性肿瘤之一,并且其发病率呈逐年上升趋势,严重危害广大妇女的健康。化疗是乳腺癌治疗的重要手段,但在化疗过程中出现的肿瘤耐药严重影响了化疗成功率。因此,深入研究乳腺癌耐药机制是亟待解决的科学问题。CBR3-AS1（CBR3 antisense RNA 1）又被称作PlncRNA-1,定位于染色体21q22.12,有3个转录产物。目前报道CBR3-AS1在前列腺癌、肝癌和食管鳞状细胞癌等癌组织中高表达,并与患者不良预后相关。CBR3-AS1可通过作用雄激素受体促进前列腺癌发生发展及增殖。在前列腺癌中CBR3-AS1可通过HER-2通路调控细胞周期、增殖、自噬以及凋亡。但目前尚未见CBR3-AS1调控乳腺癌耐药性的相关报道。本课题研究结果将以ceRNA这一研究新视角,揭示乳腺癌细胞耐药的新机制,阐明CBR3-AS1以ceRNA方式双靶向调控MEK4和JNK1介导的乳腺癌耐药的分子机制,本课题的研究结果将为阐明乳腺癌耐药作用的分子机制提供新思路,为发现有效逆转乳腺癌耐药的新型靶基因及作用位点提供理论与实验依据。研究方法:1、高通量细胞芯片通过高通量细胞芯片比较乳腺癌药物敏感细胞MCF-7与乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR lnc RNA表达差异。2、细胞模型构建通过转染CBR3-AS1过表达质粒或si-CBR3-AS1 siRNA构建乳腺癌细胞CBR3-AS1差异表达模型。miR-25-3p mimic或miR-25-3p inhibitor乳腺癌细胞miR-25-3p差异表达模型;JNK1 inhibitor构建JNK1沉默模型。2、qRT-PCR及Western Blot qRT-PCR检测乳腺癌细胞干预CBR3-AS1、miR-25-3p或JNK1后,CBR3-AS1、miR-25-3p、JNK1/MEK4 mRNA表达变化;Western Blot检测上述模型中JNK1、MEK4和P-gp等蛋白表达变化。3、细胞药物蓄积、药物毒性和凋亡检测采用CCK-8法检测干预CBR3-AS1后使用阿霉素处理,细胞存活率的变化;采用流式细胞仪分析细胞内药物蓄积、APC/7-AAD双染后细胞凋亡的变化。4、RNA pulldown MCF-7细胞转染CBR3-AS1过表达质粒48h后提取细胞悬液。与链霉素标记的CBR3-AS1-wild和CBR3-AS1反义序列探针结合孵育过夜,洗脱后,qRT-PCR检测是否能拉下miR-25-3p及其表达变化。5、裸鼠移植瘤体内验证健康BALB/C无胸腺裸鼠,按5×106个细胞皮下接种于裸鼠右上腋下,用于观察肿瘤生长情况,测量肿瘤大小,称瘤重,绘制移植瘤生长曲线。取移植瘤的癌巢部分组织提取RNA和蛋白进行qRT-PCR及Western Blot,分析各组裸鼠瘤组织内的JNK1/MEK4蛋白表达变化。6、原位杂交及免疫组化原位杂交检测乳腺癌肿瘤组织芯片中CBR3-AS1以及miR-25-3p表达;免疫组化检测结直肠癌组织中JNK1以及MEK4表达,并进行表达相关性分析。7、数据分析使用SPSS19.0统计软件包进行统计分析（SPSS Inc,Chicago,USA）,所有数据以均值±标准差（（?）x±SD）表示,P<0.05表示具有统计学意义。组间比较采用独立样本t检验或单因素方差分析（One-Way ANOVA）;χ2检验用来分析CBR3-AS1表达与乳腺癌临床病理参数的相关性;Kaplan-Meier绘制生存曲线。结果:1、CBR3-AS1在耐药性乳腺癌细胞中上调,与药物敏感性和乳腺癌的不良预后有关（1）通过分析耐阿霉素乳腺癌细胞MCF-7/ADR与其亲本乳腺癌细胞MCF-7中lnc RNA芯片差异表达谱发现CBR3-AS1明显高表达。通过CCLE数据库获得lnc RNA在各种乳腺癌细胞中的表达数据,以及GDSC数据库获得了这些乳腺癌细胞中ADR的IC50值。联合分析结果表明,CBR3-AS1的表达与乳腺癌细胞对ADR的抗性呈正相关（p<0.05,r>0.3）qRT-PCR检测4种乳腺癌细胞系,CBR3-AS1在乳腺癌细胞中表达随细胞耐药性升高而升高（p<0.05）,并且在MCF-7/ADR细胞中表达最为显著。（2）数据库分析CBR3-AS1高表达与乳腺癌患者不良预后有关。从GEO数据集的GSE20685数据集获得了乳腺癌患者的mRNA表达谱和临床信息,结果表明,在接受化疗的乳腺癌患者中,高表达CBR3-AS1的患者的预后较差。在TCGA数据库中,与邻近的正常组织相比,乳腺癌组织中的CBR3-AS1被上调。基因集富集分析（GSEA）显示CBR3-AS1在ABC转运蛋白信号转导途径中富集。另外,CBR3-AS1的表达与p-糖蛋白（P-gp,ABCB1）和乳腺癌抗性蛋白（BCRP,ABCG2）的mRNA表达显着相关。TCGA中乳腺癌患者OS曲线的对数秩检验还表明,与CBR3-AS1低表达相比,CBR3-AS1高表达与OS较差显着相关。（3）通过ISH评估了CBR3-AS1在中国医科大学附属第一医院的96例乳腺癌样品中的表达。CBR3-AS1水平与肿瘤大小和病理分期之间存在显着相关性。这些乳腺癌患者的总体生存曲线的对数秩检验表明,CBR3-AS1的表达升高与乳腺癌的较差OS显着相关。（4）干预CBR3-AS1后乳腺癌细胞表型变化。过表达CBR3-AS1后,MCF-7细胞药物敏感性显著降低（p<0.01）;相反,沉默CBR3-AS1后细胞的药物敏感性明显增加（p<0.01）。药物蓄积实验结果表明,过表达CBR3-AS1后MCF-7细胞内药物蓄积减少,而沉默CBR3-AS1后,细胞内药物蓄积明显增加（p<0.05,p<0.01）。流式细胞仪检测分析发现,过表达CBR3-AS1后,使用阿霉素48小时,细胞凋亡百分率可明显降低（p<0.01）。上述结果表明,CBR3-AS1与药物敏感性和乳腺癌的不良预后有关。2、CBR3-AS1通过JNK1/MEK4介导的MAPK信号途径调控乳腺癌药物敏感性的机制（1）CBR3-AS1与miR-25-3p直接结合作用qRT-PCR实验表明miR-25-3p在MCF-7/ADR细胞中的表达下调。RNA pulldown实验探针-琼脂糖磁珠-洗脱、收集RNA结合复合物;qRT-PCR检测miR-25-3p表达,检测到CBR3-AS1探针相对CBR3-AS1反义链探针组结合到更多的miR-25-3p,说明CBR3-AS1与miR-25-3p存在直接结合作用。（2）干预CBR3-AS1后JNK1和MEK4的表达变化miRDB网站预测miR-25-3p与JNK1以及MEK4 mRNA 3’UTR存在结合位点。荧光素酶报告基因实验证实miR-25-3p能够与JNK1以及MEK4 mRNA 3’UTR结合。TCGA数据库分析CBR3-AS1表达和JNK1以及MEK4 mRNA呈显著正相关（p<0.001,r>0.1）。（3）qRT-PCR分析和Western blot分析表明,添加阿霉素后,CBR3-AS1的过表达增加了细胞中JNK1和MEK4的mRNA和蛋白表达,而沉默CBR3-AS1降低了JNK1和MEK4的mRNA和蛋白表达。此外,miR-25-3p的过表达会降低MCF-7/ADR细胞中的JNK1和MEK4表达,而沉默miR-25-3p的表达可能会增加MCF-7/ADR细胞中的JNK1和MEK4表达。（4）裸鼠移植瘤体内验证CBR3-AS1对细胞药物敏感性的作用皮下注射MCF-7细胞制备裸鼠移植瘤模型,CBR3-AS1的过表达抵抗了ADR对肿瘤细胞的抑制作用,这种作用被JNK1抑制剂逆转了。此外,JNK1抑制剂可以逆转CBR3-AS1对增加肿瘤大小和重量的作用。Western blot以及免疫组化实验表明,CBR3-AS1的过表达增加了JNK1和MEK4的表达。这些结果表明,CBR3-AS1通过体内JNK1/MEK4促进乳腺癌的ADR耐药性结论:1.CBR3-AS1在乳腺癌耐药细胞中高表达,可作为癌基因促进细胞药物敏感性增强及抑制细胞凋亡。经乳腺癌患者组织样本分析CBR3-AS1与临床病理参数及预后的相关性,提示CBR3-AS1高表达时,患者无病生存期和总生存期缩短,预后不良。2.从大样本数据库综合分析,CBR3-AS1与miR-25-3p表达呈负相关,与JNK1/MEK4表达呈明显正相关。实验证实CBR3-AS1与miR-25-3p具有靶向结合作用,miR-25-3p与JNK1/MEK4 3’UTR同样具有靶向结合作用。3.CBR3-AS1的过表达增加了细胞中JNK1和MEK4的mRNA和蛋白表达,而miR-25-3p的过表达抵消了这一作用,同时CBR3-AS1导致的细胞及乳腺癌细胞移植瘤的药物敏感性减弱也可以被miR-25-3p抵消。