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酶是一种重要的生物催化剂,调节着生物体内大多数生命活动和生物系统中的信号传递,而生物体内的酶大多不是单独存在,它们或是溶解于细胞质中,或是与各种膜结构结合在一起,或是位于细胞内其他结构的特定位置上,发挥其独特的生物催化性能。因此,模拟生物体内微环境,研究酶在纳米结构材料上的组装、生物活性、电子转移、能量传递、催化和代谢行为,有助于我们探究生命活动,揭示与阐述生物分子的相互作用及其代谢反应本质。针对这一研究目的,本论文设计合成了多种纳米结构复合材料,并在该纳米结构上组装不同类型的模型酶,构建具有生物催化功能的纳米反应器和生物传感器,研究固定化酶的生物活性、催化协同效能及其在生物传感方面的应用。具体研究内容如下：(1)生命活动和生物系统中的信号传递大多是由多种生物分子共同参与完成的。体外模拟生物系统中酶的组装对于研究药物级联代谢过程中酶的协同作用具有重要的作用。鉴于此,以石墨烯作为固相基质,通过共价方式将细胞色素P4501A2酶(CYP1A2)和UDP-葡萄糖醛酸转移酶1A10 (UGT1A10)分别结合在两片石墨烯复合膜上,利用点击化学反应将这两片石墨烯复合膜连接起来构建石墨烯纳米笼,组装CYP1A2/UGT1A10双酶复合物,通过电化学驱动方式,以华法林作为底物,研究药物级联代谢过程。研究结果表明,组装在石墨烯笼中的酶具有优良的电化学活性,有效保证了底物代谢通道的形成,对华法林的级联代谢具有较高的催化效率。通过改变连接石墨烯笼上下层的聚乙二醇(PEG)的分子量,可以有效地调节纳米笼的层间距,从而可以改变酶复合物的催化活性。另外改变酶在纳米笼中的负载位置,其电化学性能也随之改变。因而本课题所构建的石墨烯纳米笼将为体外模拟生物组织以及研究生物分子的基本活动提供平台。(2)受天然体内多酶复合物的高催化效率的启发,在体外构建人工多酶复合物,模拟天然体内的代谢途径,在酶工程研究中已引起广泛的兴趣。鉴于此,将细胞色素P450(CYP450)两种酶组装于金纳米粒子/壳聚糖/石墨烯纳米复合膜(Au/CS/GR)上构建CYP450双酶复合物,利用电化学驱动的方式,研究药物的级联代谢。所制备的Au/CS/GR纳米复合膜同时兼顾优良的导电性、生物兼容性和含有丰富的功能基团等特点,是组装生物分子的理想基质。当模型双酶,CYP1A2和CYP3A4酶通过Au/CS/GR上氨基和羟基共价依次组装于Au/CS/GR纳米复合膜上时,因为CYP1A2和CYP3A4的电化学氧化还原峰的重叠,在-0.531和-0.474 V (vs. SCE)处出现一对稳定、对称的氧化还原峰,证明CYP450双酶复合物具有很好的电化学活性。利用电化学驱动方式,CYP450双酶复合物显示较强的协同催化性能,经CYP1A2代谢底物氯吡格雷生成的中间产物2-氧代氯吡格雷,经CYP3A4代谢可迅速地转化为最终产物羧基化氯吡格雷。该级联代谢过程可通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行验证。另外,所设计的CYP450双酶复合物还可以用来原位检测氯吡格雷含量,测定灵敏度达143.4 μA mM-1,检测下限(LOD)为0.63μM。因此,CYP450双酶复合物的成功构建为利用电化学驱动方式研究级联酶催化反应提供平台,而且在毒性物质检测的生物传感器和化学合成的生物反应器的构建有着潜在的应用。(3)探索和了解限域空腔内酶催化反应对理解生命过程信号传递具有重要的推动作用。利用静电吸附法将活性酶固定在TiO2纳米管阵列(TNA)内壁从而构建CYP2C9/Au/TNA纳米管阵列酶反应器。通过改变阳极氧化电位和氧化时间合成不同大小尺寸的TNA,并在其内壁电沉积金纳米粒子以改善其导电性,以细胞色素P4502C9酶(CYP2C9)作为模型酶固定在TNA管腔中。通过改变纳米管内径和管长可以有效地调节CYP2C9的酶活性和对底物甲苯磺丁脲的代谢产率。当TNA管内径和管长分别约64nm和1.08μm时,酶催化速率常数kcat和表观米氏常数Kmapp分别为9.89 s-1和4.8μM。甲苯磺丁脲的最高代谢产率达到14.6%。另外,本课题所设计的TiO2纳米管阵列也可以用于原位监测甲苯磺丁脲含量,检测灵敏度达28.8 μA mM-1,检测下限(LOD)为0.52μM。因而,该纳米管阵列酶反应器作为一个优良“容器”,可以用于研究酶生物催化和药物代谢,同时也可以潜在地应用于生物传感器的设计和用于化学合成的生物反应器的构建。(4)受生物体内酶催化机制的启发,首先合成了光敏剂2,9,16,23-四氨基钴酞菁(CoTAPc)和还原态氧化石墨烯(RGO)纳米复合物(CoTAPc/RGO)。经可见光照射,该复合物中CoTAPc激发态的电子可以经由RGO快速传递至细胞色素P450酶的血红素中心,触发细胞色素P450介导的催化循环反应过程进行。为了解体内酶催化反应的基本功能,我们通过将CYP3A4/CoTAPc/RGO复合物静电吸附在有序二氧化硅泡沫(MOSF)孔内,成功构建一类新型的基于纳米孔的酶催化反应器。为验证光驱动代谢过程,选择7-乙氧基4-三氟甲基香豆素(7-EFC)作为代谢底物,荧光光谱和质谱法监测代谢产物。研究结果表明,分散在磷酸缓冲溶液(PBS,0.1 M, pH7.4)中的C YP3A4/CoTAPc/RGO/ MOSF对底物7-EFC有优良酶催化活性,亲和作用以及较高的代谢效率。当MOSF的孔径约为80nm时,催化速率常数kcat为2.73s-1,表观米氏常数Kmapp为27.68μM。7-EFC的代谢产率达到56%。另外,CYP3A4/CoTAPc/RGO/MOSF具有较好的稳定性,可重复使用,经过十次循环使用,酶仍能保持85%的活性。因此,该基于纳米孔的酶反应器为体外研究酶生物催化和药物代谢研究可提供一个理想的平台,在以光催化进行生化合成以及毒物的生物传感检测方面具有潜在的应用。(5)建立一种流动注射-化学发光(FI-CL)夹心免疫法用于快速检测环境水样中微囊藻毒素-LR (MC-LR).首先,通过磁珠(MB)表面的羧基和聚乙烯亚胺(PEI)上的伯氨基之间形成酰胺键,将PEI修饰在磁珠表面形成MB/PEI,接着以戊二醛为交联剂将MC-LR抗体(Abl)共价固定在PEI/MB形成MB/PEI/Ab1用于捕获水样中MC-LRo将辣根过氧化物酶(HRP)和MC-LR抗体(Ab2)共同组装在二氧化硅纳米粒子表面形成信号探针(Ab2/Si),通过夹心免疫法连接到磁珠表面形成MB/PEI/Abl-MC-LR-Ab2/Si。通过流动注射化学发光法检测发光信号,从而实现MC-LR的测定。结果表明,与不修饰PEI相比,以MB/PEI作为载体捕获MC-LR抗体,CL信号增加9倍。与HRP/Ab2相比,以Si/Ab2作为信号探针,CL信号进一步增加13倍。在最佳条件下,方法的定量测定范围较宽,为0.02～200μgL-1,检出限(LOD)低至0.006 μgL-,远低于世界卫生组织(WTO)关于饮用水MC-LR为1.0μg L-1的最大允许值。方法的测定精密度和准确度也很高,相对标准偏差(RSD)为4.8%,标准加入回收率在84%和115%之间。方法操作简单、快捷方便(整个分析过程40 min左右),已成功应用于不同环境水样的微量MC-LR的分析。