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背景:心脏起搏细胞的功能障碍会导致很多疾病的发生,统称为“病态窦房结综合征”(SSS),治疗主要采用电子起搏器植入。然而,这种治疗方法也存在很多弊端,如电池老化,脱线,感染及其他并发症。电子起搏器的这些风险,刺激了生物起搏器的发展,生物起搏器可来源于多能干细胞的分化或重编码。窦房结(SAN)是心脏起搏器,间充质干细胞表达转录因子TBX18,在流入道区分化为起搏细胞,后形成SAN,且SAN的头区和尾区分别由不同的基因编码调控。骨髓间充质干细胞(BMSCs)与其他干细胞相比,具有多种潜在优势,因此BMSCs常被用作传递起博基因的工具。目的:本文拟构建TBX18腺病毒载体,体外转染成鼠BMSCs,观察能否诱导其形成起搏样细胞。方法:1.成鼠BMSCs的分离、纯化及鉴定运用全骨髓贴壁法分离培养成鼠BMSCs,并用流式细胞术鉴定所获BMSCs的纯度,镜下观察BMSCs的形态变化。2.人TBX18(hTBX18)腺病毒载体的构建先构建重组TBX18腺病毒载体(pHBAd-MCMV-GFP-TBX18)并测序,将脂质体LipofiterTM分别包裹带有目的基因的pHBAd-MCMV-GFP-TBX18的质粒和pHBAd-MCMV-GFP的辅助质粒,共转染HEK293细胞,进行扩增。采用改进的TCD50法进行病毒滴度的测定。3.hTBX18腺病毒载体转染BMSCsTBX18腺病毒载体(pHBAd-MCMV-GFP-TBX18)和 GFP 对照组(pHBAd-MCMV-GFP)分别转染 P3-P5代BMSCs,于倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况,RT-qPCR和Western blotting 检测 hTBX18 mRNA 和 hTBX1 8 蛋白的表达,已检验 TBX18基因是否成功转入BMSCs。4.起搏标志物的检测经RT-qPCR和Western blotting检测起搏细胞特有标志物的表达,如 α-actin,cTnI,HCN4 和 CX43 的表达。结果:1.流式结果显示:该法所获得的BMSCs可表达干细胞特有的标志物即CD29和CD90(约97%-99%),几乎看不到造血细胞标志物CD45的表达,表明全骨髓贴壁法可分离获得纯度较高的BMSCs,且BMSCs可稳定传代,P3-P5代细胞可用于后续实验。2.成功构建 pHBAd-MCMV-GFP-TBX18 和 pHBAd-MCMV-GFP,经测定,Ad-TBX18 的滴度为 1×1010PFU/ml。3.hTBX18腺病毒可成功转染BMSCs,且可检测到hTBX18 mRNA和hTBX18蛋白的表达(P<0.05)。4.RT-qPCR结果示:TBX18组的α-actin和HCN4 mRNA的表达明显高于GFP组和空白对照组(P<0.05),CX43mRNA的表达明显低于GFP组和空白对照组(P<0.05)。Western blotting 结果示:TBX18 组的 α-actin,cTnI 和 HCN4蛋白的表达明显高于GFP组和空白对照组(P<0.05),CX43蛋白的表达明显低于GFP组和空白对照组(P<0.05)。结论:1.用全骨髓贴壁法分离BMSCs的方法可行。2.成功构建 pHBAd-MCMV-GFP-TBX18 和 pHBAd-MCMV-GFP 腺病毒载体质粒。3.hTBX18基因可成功转入BMSCs,且可在BMSCs中稳定表达。4.人TBX18转录因子能诱导成鼠BMSCs分化为类起搏样细胞。