受天然蛋白质分子机器的启发,众多人工分子机器被设计出来以实现纳米尺度的精准运动,作为一种极佳的生物材料,利用DNA构建出的分子机器具有出色的性能,其中一类在界面上持续运动的DNA分子机器被称为DNA步行者。在电化学生物传感领域,由于DNA步行者具有的界面运动性质而受到了格外关注。通过对DNA序列进行设计合成,人们提出了一系列基于DNA步行者的电化学生物传感器,并用于对细胞、蛋白质和核酸等靶标进行检测。在本研究中,我们利用邻位链替代反应作为识别开关,在特异性识别目标物后启动单足DNA步行者,通过不断行走并打开发夹的过程实现了信号放大。通过调节单足步行者的“锚”结构序列长度等优化过程,最终使该传感器获得了优异的检测灵敏度和特异度,并通过以蛋白质和目标DNA作为靶标模型证明了该传感器具有极佳的可拓展性。目的:利用DNA分子机器的高度可编程性及出色的界面反应放大效率,构建通用型DNA分子机器-电化学生物传感器。为验证该传感器的检测性能和可拓展性,我们以DNA和蛋白质同时作为检测靶标的概念验证,旨在为实现生物靶标分子灵敏、快速和便携式的电化学生物传感提供新思路。方法:(1)通过扫描循环伏安法(Cylic voltammetry,CV)确认可抛式金印刷电极阵列的重复性。(2)通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)验证反应的可行性以及锚结构序列对步行者链W在H1(Hairpin 1)上驻留时间的调节作用。(3)通过电化学阻抗谱(Electrochemical impedance spectroscopy,EIS)和差分脉冲伏安法(Differential pulse voltammetry,DPV)定性表征传感器的制备过程和检测可行性。(4)以凝血酶,目标DNA分别作为蛋白质和核酸检测的靶标以验证方法的灵敏度,特异度,并通过优化H1浓度,P1-W与H1的比例,“锚”结构序列的长度,反应时间和H2浓度提高方法的检测性能。结果:(1)通过CV图谱中8个金工作电极的曲线高度重合及氧化峰与还原峰之差值低于80 mV可表明金印刷电极阵列的重复性较好,各工作电极间结果可比,且该电极可直接用于修饰及后续制备过程。(2)通过非变性PAGE证明了W链可以将H1打开,并被H2(Hairpin 2)替代后产生循环,在此过程中通过引入“锚”结构序列可以使W稳定结合于H1,进而从理论上证明W在“锚”结构序列的辅助下可通过直接接触碰撞的方式打开邻近的H1。(3)通过EIS图谱依次扫描裸金工作电极,P1-W和H1修饰于电极,六巯基己醇(6-Mercapto-1-hexanol,MCH)封闭电极后和加入凝血酶,P2’和H2-Fc的Tris-HCl后的EIS Nyquist图,通过其电化学阻抗值升高表明DNA的逐步修饰过程或通过使DNA更加竖直以增大电化学阻抗效应过程。通过DPV定性实验扫描将生物传感器置于(a)Tris-HCl,(b)(a)加入H2-Fc,(c)(b)加入P2’,以及(d)(c)加入凝血酶的DPV曲线图。由最终只有目标物存在的情况下产生了明显的DPV信号得出该策略具有发展为定量方法的能力。(4)所提出的生物传感方法对于凝血酶和目标DNA在室温下实现了线性范围分别为0.2 pM~2 nM和1 pM~10 nM,最低检测限(Low detection limit,LOD)分别为0.11 pM和0.61 pM,显示出该方法较高的检测灵敏度。通过检测甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP),癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA),凝血酶及三者混合物的DPV峰值电流,得出该方法具有较高的检测特异度。通过条件优化实验进一步提高了方法的检测性能,并发现对于H1浓度,P1-W与H1比例及“锚”结构序列的长度均存在最佳值。结论:(1)提出了一种邻位链替代开关激活的锚定单足DNA步行者,基于“锚”结构序列对DNA步行者的驻留时间调整提高了步行放大效率。(2)根据这种DNA步行者提出的电化学生物传感策略具有一步,无酶参与反应的特点,可在室温下进行直接检测,使该策略在蛋白质或核酸检测方面均具有较好的可拓展性。