目的：血吸虫病(schistosomiasis)是由血吸虫(Schistosoma)感染引起的一种分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病。血吸虫为吸虫中罕见的雌雄异体形态特征,雌雄虫体之间的相互作用对血吸虫性器官的发育和产卵起着至关重要的作用,血吸虫雌虫性器官的发育成熟和产卵必须通过雌雄虫合抱这一生物学表象方可完成。成熟雌虫所产生的大量虫卵而引起的脏器病变是造成宿主主要病理损害和疾病传播的前提。本研究目的为筛选鉴定日本血吸虫雌虫在合抱前期(感染后16天)、合抱初期(感染后18天)和合抱后期(感染后24天)差异表达基因,确定其为雌虫生殖发育相关的关键分子,加深对合抱的血吸虫性发育成熟和产生活性虫卵的理解,为控制血吸虫病的流行和危害寻找新的靶标。方法：应用日本血吸虫感染模型,给以每只昆明鼠感染70条左右尾蚴,分别于14、15、16、17和18天剖杀小鼠,灌注法收集虫体,观察计数该时间段雌雄合抱的对数,确定血吸虫雌雄合抱前和雌雄合抱初期的具体时间。再应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH))筛选日本血吸虫雌虫在雌雄合抱前(感染后16天)、合抱初期(感染后18天)和合抱后期(感染后24天)的差异表达基因。先用合抱初期的雌虫cDNA作为检测子(tester),合抱前期的雌虫cDNA作为驱赶子(driver),检测子消减驱赶子富集合抱初期的高表达基因,驱赶子消减检测子富集合抱前期的高表达基因；再用合抱后期的雌虫cDNA作为检测子,合抱初期的雌虫cDNA作为驱赶子,检测子消减驱赶子富集合抱后期的高表达基因的,驱赶子消减检测子富集在合抱初期高表达基因,从而找出血吸虫雌虫合抱前、合抱初期以及合抱后期的差异表达基因。利用生物信息学分析工具对上述所有筛选出的差异基因所编码的蛋白进行GO功能分类和KEGG代谢通路分析,依据分析结果推测其中28个可能是参与雌虫生殖发育密切相关的基因,再用RT-qPCR (Real time quantity polymerase chain reaction)以不同发育期的雌虫cDNA为模板对该28个基因进行进一步的验证。从血吸虫雌虫中分离卵巢,提取卵巢总RNA,再分别卵巢cDNA和成虫从cDNA为模板,使用RT-qPCR观察这些与生殖发育相关基因在卵巢的表达量。结果：根据小鼠感染后不同时间血吸虫合抱发生状态的试验,确定血吸虫感染小鼠16天时为合抱前期,18天时为合抱初期,24天为合抱后期(性器官基本发育成熟)。用SSH技术成功构建了日本血吸虫雌虫合抱初期和合抱前期的正、反向消减文库,即相对于合抱前期的合抱初期高表达基因cDNA文库和相对于合抱初期的合抱前期高表达基因cDNA文库。同法还构建了血吸虫感染雌虫合抱后期与合抱初期的正、反向消减文库,即相对于合抱初期的合抱后期高表达基因cDNA文库和相对于合抱后期的合抱初期高表达cDNA文库。对相对于合抱前期的合抱初期高表达基因、相对于合抱初期的合抱前期高表达基因、相对于合抱初期的合抱后期高表达基因以及相对于合抱后期的合抱初期高表达基因进行测序,去除重复序列、序列拼接之后,分别获得112个、96个、195和172个高表达基因序列标签(Expressed Sequence Tag, EST),通过与数据库进行比对,得到有明确注释信息的分别有92、80、103和90个EST序列。对这些EST所编码蛋白的分子功能、细胞定位、参与的生物学过程进行基因本体论(Gene Ontology,GO)注释。相对于合抱前期的合抱初期高表达基因主要参与的生物学过程为环状化合物代谢过程、含氮化合物的代谢过程、细胞大分子生物合成过程、氧化-还原过程等。相对于合抱初期的合抱前期高表达基因主要参与的生物学过程包括含氮化合物的代谢过程、磷代谢过程、环状化合物代谢过程、小分子代谢、转运过程等。相对于合抱初期合抱后期高表达基因主要参与的生物学过程如转运、碳水化合物的代谢过程、核苷酸代谢、小分子代谢过程等。相对于合抱后期的合抱初期高表达基因主要参与的生物学过程包括转运,核苷酸代谢、磷代谢、跨膜转运等。使用京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)对相对于合抱前期的合抱初期高表达基因、相对于合抱初期的合抱前期高表达基因、相对于合抱初期的合抱后期高表达基、以及相对于合抱后期的合抱初期高表达基因编码蛋白所参与的信号通路进行分析。KEGG分析发现相对于合抱前期的合抱初期高表达基因和相对于合抱初期的合抱前期高表达基因所编码蛋白参与76条信号通路；从合抱后期高表达基因而相对于合抱初期的合抱后期高表达基因和相对于合抱后期的合抱初期高表达基因这所编码蛋白参与79条信号通路。多个高表达基因集中参与上述信号通路主要包括代谢通路,氧化磷酸化过程,内质网蛋白质加工过程,特别是发现了与生殖发育相关的信号通路高表达基因。在这些信号通路中筛选出28个可能与生殖发育信号通路相关的基因进行荧光定量PCR的进一步验证,结果18个基因经验正与消减杂交结果一致。其中有与生殖发育直接相关的参与泌乳素和雌激素信号通路的酪氨酸激酶(tyrosine kinases, Tks)、热休克蛋白70(Heat shock protein70,HSP70)和热休克蛋白90(Heat shock proteins90, HSP90)、TGF-β信号通路相关的Type V collagen蛋白、参与Wnt信号通路的早老素蛋白、参与酵母细胞的发育周期的NIPBL蛋白(Nipped-β-like protein)和参与Hippo信号通路中的mob蛋白。其中HSP70、HSP90和早老素蛋白(presenilin)在合抱后期的雌虫的基因水平明显上调,而酪氨酸激酶、Type V collagen蛋白、NIPBL蛋白和mob蛋白在合抱初期雌虫的基因水平明显上调。RT-qPCR技术对雌虫生殖器官卵巢cDNA和雌虫成虫cDNA的Tyk、HSP90、 Type V collagen蛋白、早老素蛋白、NIPBL蛋白(Nipped-β-like protein)和mob蛋白的分析,结果显示NIPBL蛋白和早老素蛋白在卵巢高表达。结论：本实验通过抑制性消减杂交技术成功构建了日本血吸虫雌虫合抱前期、合抱初期、合抱后期的消减cDNA文库。筛选出7个可能直接与血吸虫雌雄合抱和产卵相关的分子包括Tks、HSP70和HSP90、Type V collagen蛋白、早老素蛋白、NIPBL蛋白、mob蛋白等。其中有的Tks、HSP70参与血吸虫生殖发育的功能已经有文献报道,Type V collagen蛋白、早老素蛋白、NIPBL蛋白、mob蛋白参与血吸虫生殖发育的功能尚有待进一步明确。