病理性心肌肥大是心脏对抗各种损伤因素的共同反应,持续的心肌肥大最终将导致心肌重构、心室扩张和心功能障碍。越来越多的研究旨在确立心肌肥大发展及向心衰转变的分子机制。目前许多研究通过药理性抑制剂显示,ROCK在心肌肥大和心肌重构中发挥作用。本论文第一章将利用基因敲除技术,在动物水平深入探讨ROCK家族的ROCK1亚型在心肌病理性重构中的作用。心肌细胞凋亡一直被认为是病理性心肌肥大向心衰转变的关键因素。然而即使在病理性刺激下,成年心脏心肌细胞凋亡率仍然很低,因此,心肌细胞凋亡在心肌病理性重构中的作用越来越受到质疑。基于此,本论文第二章将通过对比生理和病理情况下心肌细胞凋亡的年龄相关性差异,探讨心肌细胞凋亡在不同年龄心肌病变中的重要性。第一章ROCK1缺失抑制病理性心肌肥大模型心肌扩张并改善收缩功能研究背景病理性心肌细胞肥大是心脏对抗血流动力学增加、肌损伤和神经激素应激等的共同反应,持续的心肌肥大最终将导致失代偿性充血性心衰,表现为心室扩张和收缩功能障碍。越来越多的研究旨在确立心肌肥大发展以及向心衰转变的分子机制。Gq为一类异三聚体GTP结合蛋白。由α、p和γ亚基组成。大量研究表明,Gq信号通路是心肌肥大发展和心脏失代偿的关键调节因素。心肌细胞特异性转基因过表达Gα亚单位(Gαq)小鼠是一个已经定性的病理性心肌肥大模型,在分子水平、细胞水平和整体水平模拟了许多压力超负荷诱导的心肌肥大的特征,如：左心室扩张、基础水平和p-肾上腺素受体刺激后的心室收缩功能减退、基础水平和激动剂刺激的腺苷环化酶(adenylyl cyclase, AC)活性下降、以及心肌基因表达向胎儿模式转变。许多研究阐述了Gαq过表达所致心肌细胞肥大、心室扩张和心功能障碍的可能机制,包括：PKCα表达和活性增加、AC表达和活性下降、MEKK1/JNK信号途径的异常等。ROCK是RhoA GTPase的下游信号分子,在RhoA调控压力纤维形成、平滑肌收缩、细胞粘附等多种事件中扮演关键角色。最近有在体实验使用ROCK抑制剂Y27632和法舒地尔提示,ROCK在心肌肥大和心肌重构中发挥作用。但这些药理性抑制剂不能区分ROCK家族两个亚型ROCK1和ROCK2。我们最近的研究显示,ROCK1基因缺失纯合子小鼠(ROCK-/-)心肌在对压力超负荷的反应中,心肌间质纤维和心肌细胞凋亡较WT小鼠显著减少,但仍然发展了心肌细胞肥大。另一个研究也显示,在血管紧张素2刺激后,ROCK+/-杂合子小鼠发展了心肌肥大,但血管外周纤维化较WT明显减少。许多研究通过体外实验表明,RhoA/ROCK协同Gαq信号通路,参与了G蛋白偶联受体激动剂诱导的心肌细胞肥大。然而,至今没有在体实验表明两条通路之间的相互作用。本研究联合心肌细胞特异性Gαq过表达心肌肥大模型和ROCK1基因敲除小鼠,检验了ROCK1和Gαq通路间的相互作用,探讨了ROCK1缺失对Gαq过表达小鼠心肌内部变化所致扩张型心肌病变的影响,也为进一步明确ROCK1和ROCK2亚型的独立作用奠定了基础。第一节ROCK1缺失阻止Gαq小鼠心肌扩张并改善心收缩功能方法(1)生存实验：FVB雄性小鼠,分设4组(n=5)：野生型组(WT)、心肌细胞特异性Gaq过表达组(Gαq)、Gαq过表达与ROCK1基因敲除混合组(Gαq/ROCK1-/-)、ROCK1基因敲除组(ROCK1-/-)。所有动物正常饲养至12月龄,采用SPSS软件绘制Caplan-Meier生存曲线。在10月龄行超声心动分析。(2)其他蛋白分析、组织学和功能实验：FVB雄性小鼠,分设4组(n=4)：WT、Gαq、Gαq/ROCK1-/-、 ROCK1-/-。所有动物至12周龄,行心功能分析后,断颈处死并分离心脏。心脏保存于液氮,或行冰冻或石蜡包埋。结果1.Gαq、ROCK表达水平分析：(1)在Gαq和Gαq/ROCK1-/-小鼠心肌组织内,Gαq表达水平较WT组和ROCK1-/-组显著增高,且在各转基因组小鼠表达一致,ROCK缺失没有影响心肌组织内Gαq的过表达水平；(2)ROCK1-/-和Gαq/ROCK1-/-小鼠心肌组织内不表达ROCK1; ROCk2的表达在各组小鼠间没有差异；(3)ROCK活性水平没有随ROCK1缺失和Gαq过表达而改变；2.ROCK1缺失显著延长了Gaq小鼠的存活时间。3.ROCK1缺失没有阻止Gαq小鼠心肌细胞肥大性发展：(1)形态学分析显示,ROCK1缺失没有明显抑制Gαq过表达诱导的心脏重量增大；(2)超声扫描分析显示,ROCK1缺失没有明显降低Gαq过表达诱导的小鼠左心室质量增大；(3)组织学切片染色显示,ROCK1没有明显降低Gαq过表达诱导的左心室心肌细胞肥大；4.ROCK1缺失部分抑制了Gαq过表达诱导的心肌肥大标志物mRNA水平上调；5.ROCK1缺失阻止了心肌细胞特异性Gαq过表达诱导的左心室扩张和左心室收缩功能障碍：(1)超声扫描分析显示,ROCK1缺失明显抑制了Gαq小鼠左室内径增大及室壁变薄；(2)组织学切片染色显示,Gαq小鼠为左室离心性肥大,而Gαq/ROCK1-/-混合小鼠为心室向心性肥大；(3)超声扫描分析显示,ROCK1缺失明显阻止了Gαq小鼠左室短轴缩短率(fractional shortening, FS)和射血分数(ejection fraction,EF)降低；(4)形态学分析显示,ROCK1缺失阻止了Gαq小鼠的肺水肿。结论ROCK1基因缺失抑制了心肌细胞特异性过表达Gαq转基因小鼠的心室扩张,改善了其心功能,并显著延长了Gαq小鼠的寿命。刍二节ROCK1缺失阻止Gαq小鼠心肌AC5/6下调并恢复心肌β-AR功能方法FVB雄性小鼠,分设4组：WT、Gαq、Gαq/ROCK1-/-、ROCK1-/-。所有动物至12周龄,行心功能分析后,断颈处死并分离心脏。心脏保存于液氮,或行冰冻或石蜡包埋。部分实验动物给予腹腔注射异丙肾上腺素(ISO,100ng/g体重),在注射前和注射后5分钟分别进行超声心动检测。结果1.Gaq和Gαq/ROCK1-/-小鼠心肌组织没有发展明显的心肌纤维化。2.Gαq和Gαq/ROCK1-/-小鼠没有明显的心肌凋亡。3.异丙肾上腺素刺激后,ROCK1基因缺失显著改善了Gαq心肌对p-肾上腺素受体刺激的低反应性。4.ROCK1缺失恢复了心肌特异性Gαq过表达诱导的AC5/6下调。5.ROCK1缺失没有抑制心肌细胞特异性Gαq过表达诱导的MAPK活化和PKCα活化。结论ROCK1缺失明显抑制了心肌细胞特异性Gαq过表达诱导的AC5/6蛋白水平下调和p-肾上腺素受体功能障碍,从而改善了Gαq小鼠的心功能不全。ROCK1基因缺失明显抑制了心肌细胞特异性Gαq过表达诱导的心室扩张、AC5/6的蛋白水平下调和β-肾上腺素受体功能障碍,从而改善了Gαq小鼠的心功能,并显著延长了Gαq小鼠的存活时间。第一节Caspases依赖性心肌细胞凋亡的年龄差异性比较研究背景介导Caspases依赖性细胞凋亡的信号通路包括外部凋亡途径和内部调亡途径,caspase8和caspase9分别是外部和内部通路的凋亡起始者,两条通路最终汇合于凋亡执行者caspase3的活化。在内部凋亡途径,Apafl作为接头蛋白,连接细胞色素C和pro-caspase9,为pro-caspase9活化所必需。Bcl-2家族是内部凋亡途径最主要的调节因子,包括：促凋亡蛋白Bax、Bak、BH3、蛋白如Bad、Bid、Nix和BNip3,抑凋亡蛋白Bcl-2,Bcl-XL和Mcl-1。心肌细胞凋亡在心脏胚胎发育期扮演关键角色,而在出生后成熟的心肌非常罕见。无数研究表明心肌细胞凋亡在许多心肌病变中成百倍上调,然而即使在这些病理情况下,成年心肌细胞凋亡率仍然很低。研究也显示,幼年心脏比成年心脏对各种刺激更加敏感。我们推测心肌细胞死亡和增殖相关基因表达模式或蛋白活性的年龄依赖性变化,是幼年和成年心脏对刺激敏感性不同的根本原因之一。我们首先系统比较了正常小鼠从出生到成年心脏发育过程中,生理条件下心肌细胞凋亡及其关键信号分子包括：caspase3、caspse8、 caspase9、Apafl、Bax等的表达或活性的变化；并将TUNEL原位染色法与特异性标记心肌细胞核的方法结合,较准确地定量了生理条件下不同年龄阶段的心肌细胞凋亡。方法实验使用FVB品系野生型小鼠(WT)或心肌细胞核特异性过表达lacZ的FVB小鼠(αMHC-nlacZ)。有关caspase3活性检测和caspases蛋白表达分析的实验部分,WT小鼠分为6组：雄或雌性出生后1天、出生后3天、1周龄、2周龄、雄性3周龄、雄性5周龄。有关活化caspase3免疫组化染色、TUNEL染色及其他凋亡相关蛋白分析的实验部分,WT或nlacZ小鼠分设3组：雄或雌性1周龄、雄性3周龄、雄性5周龄；在活化caspase3免疫组化染色和TUNEL染色实验中,先行p-半乳糖苷(β-gal)染色,以特异性标记心肌细胞核。结果1. aMHC-nlacZ小鼠心脏冰冻切片行β-gal染色后,可见心肌细胞核呈淡蓝色,而胞浆和其它类型细胞核未染。2. Caspase3活性实验显示,小鼠心肌组织caspase3活性随年龄增大而显著降低。出生1周内的心肌组织具有相对高的caspase3活性,2周龄时仍可以检测到少量caspase3活性,3周以后已基本检测不到活化的caspase3。3. β-gal染色结合免疫组化染色、以及Western blot结果显示,小鼠心肌细胞内活化caspase3的表达水平随年龄增大而显著减少,3周龄以后的心肌细胞不表达活化caspase3。4. p-gal染色结合TUNEL染色显示,小鼠心室肌细胞凋亡随年龄增大而显著减少。1周龄时心室肌细胞仍有一定比率的凋亡发生,而3周以后罕见心肌细胞凋亡。5. Western blot结果显示,出生1周内pro-caspase3的表达水平较高,2周后明显降低,3周后极其微弱；pro-caspase9和pro-caspase8的表达水平同样随年龄增大而明显降低。6. Western blot结果显示,心肌组织内部凋亡途径信号分子Bax、Apafl的表达随年龄增大而显著下降。7.心肌组织内其他细胞增殖和生存相关蛋白如Akt/p-Akt。p-P53、p-p38和p-p42/44的表达水平均没有呈现年龄相关性变化。结论出生后心肌生理性发育的早期,细胞凋亡通路及心肌细胞凋亡较成年心肌尤为活跃,这可能是幼年心脏对病理性刺激高敏感性的分子基础之一。研究背景阿霉素(Doxorubicin, DOX)是目前应用最广泛和有效的抗肿瘤药物之一。但是严重的心脏毒性限制了DOX的使用剂量和疗程。研究显示心肌细胞凋亡在DOX诱导的心肌毒性反应中扮演重要角色。但目前有关DOX心肌毒性的在体研究绝大部分是采用成年动物模型,其病理情况下的心肌细胞凋亡率仍然很低；而且目前有关原位检测心肌细胞凋亡的方法如TUNEL染色,均不能准确区分心肌细胞和非心肌细胞。因此心肌细胞凋亡在病理性因素比如DOX刺激诱导的心肌病理性发展、尤其是成年后心肌重构中的重要性越来越受到质疑。临床研究也表明,接受DOX治疗的儿童和青少年对其心脏毒性影响较成年尤为敏感,大部分儿童在完成疗程一年或多年以后发生心肌病变。可能的原因为心肌细胞丢失、心肌生长损害,导致左心室发育不全和心肌病变。然而其最根本的分子机制至今不明。我们在前一节所述的动物实验以及其他少数研究提示,幼年心肌细胞内部凋亡途径的相对高水平、尤其是凋亡执行者caspase3的高表达,可能是儿童对DOX心脏毒性较成年更为敏感的原因之一。因此本实验中,我们使用在体给予DOX的心肌毒性动物模型,比较了在DOX刺激的早期,幼年和成年心肌细胞凋亡及其相关信号通路的差异。并结合特异性标记心肌细胞核的方法,准确定量DOX诱导的心肌细胞凋亡,衡量了心肌细胞凋亡在不同年龄阶段DOX所至心肌病变中的重要性。方法实验使用FVB品系WT或αMHC-nlacZ小鼠：(1)观察不同浓度DOX对1周龄小鼠心肌组织caspase3表达的影响：分为5组(n=4)：对照组(1wk-ctrl); DOX5mg/kg处理组(1wk+5);DOX10mg/kg处理组(1wk+10)；DOX15mg/kg处理组(1wk+15)；DOX20mg/kg处理组(1wk+20)。所有实验动物单次腹腔注射不同浓度DOX或等量生理盐水,24小时后断颈处死动物,迅速收集心脏,存于液氮。(2) DOX10mg/kg对1周龄小鼠心肌组织caspase3表达影响的时间曲线分析：分为7组(n=4)：DOX处理0小时组(对照组),DOX处理2,4,8,12,16,24小时组。DOX注射方式及标本采集方式同上。(3)观察DOX(低浓度和高浓度)对不同年龄小鼠心肌细胞凋亡及凋亡信号通路的影响：分为9组(n=4)：1周龄对照组(生理盐水组,1wk-ctrl);1周龄DOX10mg/kg处理组(1wk+10)；1周龄DOX20mg/kg处理组(1wk+20)；3周龄对照组(3wk-ctrl);3周龄DOX10mg/kg处理组(3wk+10)；3周龄DOX20mg/kg处理组(3wk+20)；5周龄对照组(5wk-ctrl);5周龄DOX10mg/kg处理组(5wk+10)；5周龄DOX20mg/kg处理组(5wk+20)。DOX注射方式及标本采集方式同上。结果1.1周龄小鼠心肌组织活化caspase3的表达水平及PARP剪切产物呈DOX浓度依赖性增加,在DOX10mg/kg处理后增加具统计显著性。2. DOX10mg/kg处理后,1周龄小鼠心肌组织活化caspase3的表达水平逐渐增高,并在处理24小时后达峰值。3. DOX10mg/kg处理24小时后,1周龄小鼠心肌组织caspase3活性显著增高,DOX20mg/kg处理后进一步增高。4.1周龄小鼠心肌细胞凋亡率呈DOX浓度依赖性显著增高。5.1周龄小鼠心肌组织活化caspase9的表达水平呈DOX浓度依赖性显著增加。6.DOX处理后,Bax的表达水平在初生和成年小鼠心肌组织均显著增高。7.DOX10或20mg/kg处理24h后,3周龄和5周龄小鼠心肌组织均没有呈现caspase3活性。8.DOX10或20mg/kg处理24h后,在3周龄和5周龄小鼠心肌组织没有检测到活化caspase3表达。9.DOX10或20mg/kg处理没有诱导3和5周龄小鼠心肌细胞凋亡发生。10.DOX10或20mg/kg处理没有诱导3和5周龄小鼠心肌组织活化caspase9表达。11.各年龄心肌组织pro-caspase3、pro-caspase9、Bax、Apaf、XIAP、 pro-caspase8、活化caspase8的表达没有呈现DOX相关性变化。12.各年龄心肌组织细胞增殖或生存相关蛋白如Akt/p-Akt、p-P53、p-P38、p-P44/42等的表达水平均没有呈现DOX相关性改变。结论心肌细胞凋亡是幼年时期接受DOX治疗后心肌病变的早期和根本原因之一,也是幼年心脏对DOX毒性较成年心脏更为敏感的根本原因之一。本研究首次通过动物模型证实,幼年心脏心肌凋亡能力明显高于成年心脏,心肌细胞凋亡是幼年时期接受阿霉素治疗后心肌病变的早期和根本原因之一,也是幼年心脏对阿霉素毒性较成年心脏更为敏感的根本原因之一。