论文部分内容阅读
本研究将磁性纳米颗粒与分子印迹技术相结合,开发一种蛋白质快速高效分离纯化新方法,为复杂体系中蛋白质的快速高效分离纯化提供一种新思路。本研究制备了硅氧基（O-Si-O）和羧基（-COOH）等基团修饰的磁纳米颗粒Fe3O4@SiO2-AA,以牛血红蛋白（bovine hemoglobin,BHb）作为模板在磁颗粒上进行分子印迹反应,成功制备了分子印迹磁性纳米颗粒（magnetic molecularly imprinted nanoparticles,MIP）,对MIP进行表征,并对其对蛋白质的吸附分离和洗脱性质进行了研究,具体研究内容如下:首先,利用化学沉淀法制备Fe3O4纳米颗粒,对Fe3O4纳米颗粒进行O-Si-O和-COOH等基团的修饰得到Fe3O4@SiO2-AA颗粒。选择甲基丙烯酸（methylacrylic acid,MAA）和衣康酸（itaconic acid,IA）作为功能单体,N’N-亚甲基双丙烯酰胺（N’N-methylene bis acrylamide,N’N-MBA）作为交联剂,利用分子印迹技术制备MIP颗粒。研究发现当采用0.3%Fe3O4@SiO2-AA颗粒,0.35%甲基丙烯酸,0.125%衣康酸和0.08%的N’N-MBA进行分子印迹时,所得到的MIP颗粒具有最优的BHb分子吸附量。其次,对所得磁颗粒进行了表征。利用傅里叶红外光谱分析发现O-Si-O和-COOH基团以及分子印迹聚合层成功地修饰在磁颗粒表面。透射电子显微镜表征发现MIP颗粒的粒径大致在20 nm左右,具有良好的分散性。通过热重分析发现MIP颗粒的磁含量约为84%,分子印迹层稳定性好。元素分析结果显示MIP的C含量为4.06%,MIP颗粒中模板蛋白BHb分子已完全洗脱。Zeta电位分析显示MIP的等电点为pH 4.5左右,也说明了所需基团和分子印迹聚合物的成功修饰。再次,本论文研究了不同环境条件对MIP吸附BHb过程的影响,并探究了其吸附机理。吸附动力学研究发现吸附12 h时,MIP颗粒对BHb的吸附达到平衡,获得了最大吸附量116.69 mg/g颗粒,吸附过程符合拟二级动力学模型。等温吸附研究得出吸附过程中BHb的最佳初始浓度为1.0 mg/m L,并且吸附过程符合Langmuir等温吸附模型描述的单分子层吸附。由不同溶液条件下MIP颗粒对BHb吸附量的研究可知,在pH 6.2时,由于静电吸引作用,MIP颗粒的吸附量可以达到169.29 mg/g颗粒。在NaCl浓度较低时,由于低浓度盐溶液对蛋白质的结构稳定作用,MIP颗粒对BHb的吸附量较大,而在高浓度NaCl溶液中,由于电荷屏蔽及蛋白质结构的变化,MIP颗粒对BHb的吸附受到抑制。在不同浓度尿素溶液中的吸附结果显示,MIP颗粒与BHb之间的氢键作用对其吸附效果具有一定程度的贡献。在SDS（sodium dodecyl sulfate）溶液和高浓度的尿素溶液中,蛋白质空间结构的改变使MIP对其吸附作用大大减弱。由MIP对BHb的选择性和竞争性吸附可以发现,MIP颗粒仅对模板蛋白有特异性的吸附作用,对其他蛋白质的吸附作用较弱。此外,本论文研究了不同洗脱液对MIP颗粒上BHb的洗脱效果,结果发现去离子水对BHb具有较高的洗脱率（64.23%）,而以不同浓度NaCl溶液、不同pH值的PBS溶液、不同浓度的尿素溶液作为洗脱液对BHb的洗脱率均小于去离子水。用SDS溶液作为洗脱液结果显示,当SDS的浓度达到1%以上时,其对MIP颗粒上BHb分子的洗脱率十分接近100%。对不同洗脱液的洗脱得到的蛋白质结构分析得,去离子水、NaCl洗脱液、PBS洗脱液洗脱得到的BHb分子结构保持良好,不易发生变性,而高浓度的尿素溶液以及SDS溶液洗脱得到的BHb结构发生了变化。最后,在经过5次重复吸附洗脱实验后,MIP颗粒对BHb分子的吸附量仍可以达到110 mg/g以上,颗粒具有良好的材料稳定性和重复使用性。