目的:大肠癌是严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一,全世界每年约有100万的新增病例,约有50万人死于大肠癌。在过去的几十年中,尽管通过早期筛查的诊断方法和治疗方式的改变降低了死亡率,但仍没有有效的方法提高患者的总体生存率。从分子生物学层面探讨大肠肿瘤发生、发展的机制是目前研究的热点,因此,发现靶基因治疗的新目标,尤其是那些对促进增殖和侵袭转移起明显作用的分子,是目前急需解决的问题。1.探讨临床大肠癌组织标本中REG1B蛋白的表达,分布状况及其与临床因素的关系,并检测相关大肠癌细胞株sw480、sw620、HCT116中REG1B mRNA和蛋白质的表达。2.构建靶向特异的REG1B干扰质粒并筛选出干扰效率较高的序列,为后续的研究打基础。3.探讨REG1B基因干扰对大肠癌细胞株细胞增殖、凋亡、细胞周期及细胞迁移和侵袭转移等生物学行为的影响。4.EG1B基因干扰后,用明胶酶谱法检测MMP-2及MMP-9的活性;利用免疫沉淀法研究REG1B与Il-6之间是否存在直接的相互作用,初步探讨基因沉默抑制大肠癌细胞迁移和侵袭的分子机制。方法:1.临床收集30例大肠癌组织和癌旁正常组织标本,制成石蜡切片标本。采用免疫组化方法检测这些标本中REG1B蛋白的表达及分布,分析它们的临床意义;采用Real time RT-PCR、Western blot及免疫荧光方法检测大肠癌细胞株SW480、sw620和hct116的reg1b蛋白质及mrna的表达。2.将3个reg1b的干扰序列连接到gv102载体上,之后测序检测干扰序列的正确性;利用脂质体2000转染hct116细胞,并利用荧光显微镜、realtimert-pcr及westernblot的方法检测reg1b的干扰效率,筛选出干扰效率最高的序列。3.利用脂质体2000转染hct116细胞,用细胞计数法绘制生长曲线、cck-8测细胞增殖的改变;利用流式细胞术进行细胞凋亡和细胞周的分析;用划痕擦伤实验检测细胞迁移的改变;利用transwell小室检测reg1b基因沉默后,大肠癌细胞迁移和侵袭性的改变。4.利用明胶酶谱法检测reg1b基因沉默后mmp-2和mmp-9的活性改变;应用reg1b多克隆抗体对reg1b表达丰富的hct116细胞总蛋白进行免疫共沉淀,然后再使用westernblot蛋白质杂交实验证实该复合物中是否有il-6表达,接着用抗il-6抗体行反向免疫共沉淀实验,证实该复合物中是否有reg1b,从而验证reg1b是否与il-6存在相互作用的关系。结果:1.大肠癌组织中reg1b的蛋白质表达明显高于癌旁正常组织,reg1b的表达与大肠癌的分化程度有关;reg1b在hct116、sw620及sw480中都有不同程度的表达,但hct116和sw620细胞中的mrna和蛋白质表达水平比sw480的水平高。2.靶向特异的reg1b干扰质粒构建成功,3个干扰质粒对mrna的干扰效率分别达到34.4%,84.2%,90%,其中第三个shrna的抑制率最高。3.reg1b基因的沉默可以抑制大肠癌细胞株的增殖,并使细胞出现g0/g1期阻滞,s期细胞百分比降低;凋亡检测结果显示,与对照组相比,reg1b的沉默,并不能增加细胞的凋亡;reg1b基因的沉默可以使大肠癌细胞株的迁移和侵袭明显减少。4.明胶酶谱实验表明,reg1b基因沉默后可以使mmp-2和mmp-9的活性降低。应用reg1b多克隆抗体对reg1b表达丰富的hct116细胞总蛋白进行免疫共沉淀,然后再使用westernblot蛋白质杂交实验,可以检测到il-6的表达,同样用抗il-6抗体行反向免疫共沉淀实验,复合物中也可以检测到reg1b。结论:1.REG1B蛋白质在大肠癌组织中表达升高,且与肿瘤的分化程度明显相关;REG1B在SW480、SW620和HCT116细胞中都有表达,但在SW620和HCT116中表达较高,由于HCT116细胞的转染效率较高,因此,被选为后续研究的工具。2.成功构建并筛选出了REG1B的特异性靶向干扰质粒。3.REG1B基因的沉默可抑制大肠癌细胞的增殖,而这一作用可能是通过影响细胞周期起作用的,而与细胞的凋亡无相关性。REG1B基因沉默后,细胞的迁移和侵袭转移能力降低,因此,REG1B具有促进大肠癌细胞迁移和侵袭转移的能力。4.REG1B基因沉默可以降低MMP-2和MMP-9的活性并且REG1B与Il-6之间存在着直接的相互作用,因此REG1B促进大肠癌细胞的迁移和侵袭,可能是通过MMP-2、MMP-9及Il-6起作用的,REG1B可做为一潜在的基因治疗靶点。