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卵黄原蛋白(Vitellogenin,VTG)是检测水环境雌激素的重要生物标志物。雄性鱼类VTG mRNA是一种检测环境雌激素的新兴生物标志物。我国水环境生物监测主要采用传统的群落学方法和生物化学检测,应用分子生物学方法检测水环境雌激素的报道较少。久效磷(Monocrotophos, MCP)是一种常用的有机磷农药,已经在我国造成了严重的农药残留污染。本文选用在我国广泛分布的鱼类——金鱼作为模式生物,研究久效磷对雄性金鱼VTG mRNA表达的影响。实验室邴欣等已成功分离纯化17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)暴露的雄性金鱼血清VTG;用非变性聚丙烯酰胺电泳(PAGE)测得VTG的分子量约为440kDa;用Western-blot技术证明在0.01 mg·L-1、0.10 mg·L-1、1.00mg·L-1三个久效磷浓度暴露组都能够诱导雄性金鱼分泌VTG。基于实验室已经完成的工作,本文采用RT-PCR检测金鱼VTG mRNA的表达,克隆编码金鱼VTG蛋白的部分cDNA片段,并以此为模板制备地高辛标记的RNA探针,用这种分子生物学技术检测环境雌激素对金鱼的雌激素效应,建立了新的筛选环境雌激素的分子生物学方法。实验所用金鱼购自青岛南山花鸟市场,驯养两周后开始实验。取雌鱼肝脏提取总RNA,根据已知氨基酸序列的鱼种设计兼并引物,RT-PCR扩增金鱼VTG基因片段,得到一条1135bp的特异性条带。将所得DNA进行测序,其序列用NCBI的Blast进行比对。结果显示,扩增所得片段与鲤鱼(Cyprinus carpio)的同源性为94%,与金鱼(Carassius auratus)同源性为93%,与鲦鱼(Pimephales promelas)同源性为90%,并且在系统发生树中与金鱼最为接近,由此可以初步认为这段序列是编码金鱼VTG的基因序列。为了进一步验证这段序列就是编码金鱼VTG的基因序列,同时建立检测环境雌激素的新方法,将所得片段转入大肠杆菌进行增殖,提取质粒,内切酶SphⅠ将质粒线性化,纯化得到高纯的线性DNA。选取Sp6 RNA聚合酶,以DNA为模板合成DIG标记的cRNA探针。用所得探针(615bp)进行Northern杂交实验,结果显示,0.01 mg L-1、0.10 mg L-1和1.00 mg L-1三个久效磷浓度组表达了与每条鱼0.2μg的17-β雌二醇暴露的金鱼相同大小的VTG mRNA。证明鱼类在久效磷诱导下能够产生与内源雌激素刺激下相同的VTG基因,进一步验证了久效磷是一种环境雌激素。本实验建立了RT-PCR与Northern杂交相结合的以VTG mRNA为生物标志物的筛选环境雌激素的分子生物学方法。