研究背景β淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)存在单体、寡聚物、原纤维、纤维等多种聚集形式,Aβ斑块沉积作为AD发病的重要病理学标志,主要以纤维形式聚集而成。已有大量文献证实Aβ寡聚物对神经元、星形胶质细胞有明确毒性作用,而Aβ纤维对于星形胶质细胞的炎症诱导作用尚不明确。在AD模型鼠脑中,星形胶质细胞的形态和基因表达发生的显著变化导致突触连接中断,神经递质稳态失衡;Aβ斑块附近的星形胶质细胞变得活跃,发生反应性增生,反应性星形胶质细胞由此产生更多聚胺降解的有毒分子。异常折叠聚集的Aβ可以与星形胶质细胞上的模式识别受体结合,触发以炎症介质释放为特征的固有免疫反应。Aβ诱导的炎症反应可通过星形胶质细胞和小胶质细胞分泌的各种细胞因子和趋化因子激活细胞的各种信号通路导致神经退行性病变。因此Aβ纤维诱导的星形胶质细胞炎症反应及对神经元的影响是AD发病机制研究的重要方向。研究目的本研究旨在探讨Aβ纤维诱导星形胶质细胞活化和增殖所产生的炎症反应,包括iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β炎症介质的表达和MAPKs/NF-κB相关炎症通路蛋白的变化,及其对神经元的影响。旨在探讨Aβ纤维诱导的星形胶质细胞活化和增殖在AD炎症机制中的作用。研究方法1、用不同浓度组(直接0μmol/L、直接1μmol/L、直接5μmol/L、直接10μmol/L、直接15μmol/L、直接30μmol/L)的Aβ纤维溶液直接刺激星形胶质细胞72h后用CCK-8法检测星形胶质细胞的细胞活性,筛选出合适的药物浓度;用上述浓度的Aβ纤维溶液刺激星形胶质细胞72h所得上清离心后分组(间接0μmol/L、间接 1μmol/L、间接 5μmol/L、间接 10μmol/L、间接 15μmol/L、间接30μmol/L)分别作用于另一组星形胶质细胞72h,用CCK-8法检测星形胶质细胞的活性。2、用不同浓度组(直接0μmol/L、直接15μmol/L、直接30μmol/L)的Aβ纤维溶液直接刺激星形胶质细胞72h,用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光染色进行星形胶质细胞的形态观察;并用蛋白免疫印迹法检测上述Aβ纤维浓度作用下星形胶质细胞GFAP蛋白表达情况。3、用不同浓度组(直接0μmol/L、直接15μmol/L、直接30μmol/L、间接15μmol/L、间接30μmol/L)的Aβ纤维刺激星形胶质细胞72h,蛋白免疫印迹法检测星形胶质细胞中iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β的蛋白表达;检测p38 MAPK、ERK1/2、p65的总蛋白水平和磷酸化蛋白水平。4、用不同浓度组(间接0μmol/L、间接15μmol/L、间接30μmol/L)的Aβ纤维作用于单独培养的神经元24h,用CCK-8法检测神经元的活性。5、将不同浓度组(直接0μmol/L、直接15μmol/L、直接30μmol/L)Aβ纤维直接刺激72h后的星形胶质细胞与神经元共培养24h,神经元由此设置分组为星胶-神经元0μmol/L、星胶-神经元15μmol/L、星胶-神经元30μmol/L,用AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡检测盒检测神经元的凋亡情况。6、蛋白免疫印迹法检测共培养体系中不同组别神经元(星胶-神经元0μmol/L、星胶-神经元 15μmol/L、星胶-神经元 30 μmol/L)的 RIPK3、MLKL、bcl-2、Bax和caspase-3的蛋白表达水平。研究结果1、Aβ纤维在5-30μmol/L浓度范围内以浓度依赖方式直接促进了星形胶质细胞的活化;产生的上清在10-30μmol/L的Aβ浓度范围内促进了星形胶质细胞的活化。2、在15μmol/L、30μmol/L浓度下的Aβ纤维使星形胶质细胞密度增加、胞体增大、形态向放射状演化、GFAP荧光强度增加等细胞增殖和形态改变;GFAP蛋白表达与作用浓度呈正比。3、Aβ纤维诱导后星形胶质细胞炎症介质蛋白表达升高;p38、ERK1/2、p65通路蛋白的总水平和磷酸化水平升高。4、Aβ纤维诱导星形胶质细胞介导神经元活性下降。5、Annexin V-FITC/PI法检测共培养体系下神经元发生凋亡和坏死比例升高。6、凋亡相关的Bax、caspase-3蛋白表达升高,坏死相关的MLKL、RIPK3蛋白水平升高。结论1、一定浓度下的Aβ纤维能够促进星形胶质细胞的活化和增殖。2、Aβ纤维可能通过激活MAPKs/NF-κB通路促进星形胶质细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS等炎症介质的表达。3、Aβ纤维诱导星形胶质细胞介导神经元发生凋亡、坏死。