动脉粥样硬化是一个全身性的病理过程,可导致动脉狭窄甚至闭塞,是造成心肌梗死、脑卒中和周围血管慢性缺血性疾病的首要病因。经皮腔内血管成形术与支架植入术是目前治疗动脉狭窄／闭塞性疾病的常用方法,然而,术后数月内血管往往会再狭窄甚至再闭塞,因此其远期疗效仍然未尽如人意。血管平滑肌细胞(VSMC)的异常增殖和迁移被认为与动脉粥样硬化和支架植入术后再狭窄有关,而表型转换是活化的VSMC发生上述生物学行为改变的基础。因此,预防和延缓VSMC的异常增殖、迁移和表型转换,对防治动脉粥样硬化和支架术后再狭窄意义重大。临床上,他汀类药物和抗氧化药物常用于防治上述疾病。他汀类药物通过抑制VSMC增殖并从诱导其凋亡,可抑制血管成形术后内膜增生,故除用于降低血脂外,已作为一种抑制内膜增生的药物广泛应用于临床。而普罗布考等抗氧化药物是一种新型的抗动脉粥样硬化药物,与VSMC的生物学行为的关系目前仍未完全明确,因此有必要探明他汀类药物和普罗布考对其生物学行为的影响,并比较两者的异同。本课题将使用氧化低密度脂蛋白(oxLDL)分别诱导大鼠VSMC发生增殖、迁移和表型转换,其后给予不同浓度的阿托伐他汀、普罗布考或两者联用,观察这两种药物对VSMC上述生物学行为的影响,并比较两者单用及联用时效应的异同和强弱,为今后临床用药提供依据和参考方案。第一部分血管平滑肌细胞的分离与培养目的从健康雄性SD大鼠胸腹主动脉中分离、培养及鉴定中膜VSMC,建立简单有效的原代VSMC培养体系。方法无菌条件下取出健康雄性SD大鼠胸腹主动脉,去除外膜及内膜后,采用组织贴块法分离和培养中膜VSMC,并适时传代、冻存和复苏。通过倒置显微镜连续观察细胞生长情况,台盼蓝染色检测细胞活力,免疫细胞化学染色鉴定细胞纯度。结果在贴块后4d-7d,原代细胞从小组织块周围萌出,随后的10d-14d细胞逐渐迁出和生长,最终融合成致密的细胞层,从贴块到原代细胞传代的时间为2w-3w。多数原代VSMC表现为典型的长梭形或三角形,胞浆丰富,生长至融合状态时呈现出“峰谷”样排列,传代后的VSMC形态和排列与原代细胞保持一致。台盼蓝染色示细胞活力为96.3±1.8%。SMα-Actin染色阳性的VSMC百分比为95.4%±2.7%。结论通过组织贴块法,可在体外成功分离获得正常大鼠主动脉中膜VSMC,其中绝大多数是收缩型细胞,而且活力好,纯度高,可用于研究VSMC的增殖、迁移和表型转换等生物学行为。第二部分 他汀类药物与抗氧化药物对血管平滑肌细胞增殖的影响目的观察他汀类药物和抗氧化药物对VSMC增殖的影响,评估两者单用及联用时的影响程度差异,并根据实验结果,确定阿托伐他汀和普罗布考的最佳作用浓度。方法用MTT比色法评估阿托伐他汀在0.1μmol/L-10μmol/L、普罗布考在1μmol/L-100μmol/L的浓度范围内,分别单用和联用时的细胞毒性。以oxLDL刺激VSMC,在上述浓度下分别单用和联用阿托伐他汀和普罗布考,比较各组VSMC的吸光值。结果在上述浓度下,阿托伐他汀(P=0.214)、普罗布考(P=0.547)和两药联用(P=0.999)对VSMC没有细胞毒性作用。oxLDL能诱导VSMC增殖,使吸光度升高,而单用普罗布考(P<0.001)和两药联用(P=0.001)可降低VSMC吸光值。阿托伐他汀和普罗布考分别在10μmol/L和100μmol/L时,对VSMC的作用最显著。结论单用普罗布考及联用阿托伐他汀与普罗布考均可显著抑制VSMC的增殖,且这一抑制作用是剂量依赖性的。单用阿托伐他汀能否抑制oxLDL诱导的VSMC增殖活动,需要更大样本量的实验证实。第三部分 他汀类药物与抗氧化药物对血管平滑肌细胞迁移的影响目的观察他汀类药物和抗氧化药物对VSMC迁移的影响,并评估两者单用及联用时的影响程度差异。方法以oxLDL刺激VSMC后,分别单用和联用阿托伐他汀(10μmol/L)和普罗布考(100μmol/L),其后在荧光显微镜下观察对照组、oxLDL组、阿托伐他汀组、普罗布考组和阿托伐他汀+普罗布考组VSMC的迁移情况,并拍照记录,计算各照片中VSMC迁移进入刮除区后在刮除区所占的面积百分比,以进行细胞平面迁移分析。结果对照组迁移VSMC占细胞刮除区内面积的百分比为5.80%±2.85%,oxLDL组为17.42%±9.97%,阿托伐他汀组为9.68%±2.65%,普罗布考组为11.84%±5.14%,阿托伐他汀+普罗布考组为5.28%±2.24%。对照组与oxLDL组之间(P=0.004)及阿托伐他汀+普罗布考组与oxLDL组之间(P=0.002)有显著性差异,其余各对比较无显著性差异。结论联用阿托伐他汀和普罗布考可显著抑制oxLDL诱导的VSMC的迁移行为。大样本量的研究或可证明单用阿托伐他汀和单用普罗布考是否确能抑制VSMC发生迁移。第四部分他汀类药物与抗氧化药物对血管平滑肌细胞表型转换的影响目的观察他汀类药物和抗氧化药物对VSMC表型转换的影响,并评估两者单用及联用时的影响程度差异。方法以oxLDL刺激VSMC,其后分别使用10μmol/L阿托伐他汀、100μmol/L普罗布考和10μmol/L阿托伐他汀+100μmol/L普罗布考,通过透射电子显微镜观察各组VSMC的形态,免疫组织化学、Western Blot和Real time PCR法检测各组细胞的VSMC表型蛋白、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达情况。结果与对照组相比,oxLDL组VSMC肌丝大量减少甚至消失,内质网等细胞器增多和扩张,线粒体也增多；阿托伐他汀组、普罗布考组和阿托伐他汀+普罗布考组VSMC的肌丝多于oxLDL组但少于对照组,而内质网则少于oxLDL组VSMC。oxLDL组VSMC的SMa-Actin、SM-MHC和Smoothelin的表达量在蛋白水平和mRNA水平上均显著降低,而OPN水平显著增高,胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ也显著增多。阿托伐他汀组和普罗布考组的收缩型标志物表达水平高于oxLDL组但低于对照组,OPN和胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的水平则低于oxLDL组。阿托伐他汀+普罗布考组VSMC的收缩型标志物表达水平比阿托伐他汀组和普罗布考组更高,OPN和胶原蛋白水平则比之更低。结论阿托伐他汀和普罗布考单用时可抑制VSMC发生表型转换,而联用两药时其抑制效应更为明显。