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紫杉烷类化合物最初是从植物中得到的天然产物,结构分类属于二萜类,又称紫杉烷二萜。其中,紫杉醇是一种高效、低毒、广谱、作用机制独特的天然抗肿瘤药物。紫杉烷类药物的市场供应受制于原料来源和制备技术两方面,药价昂贵。真菌大规模工业发酵生产具有广阔的发展前景,将产生巨大的社会效应和市场效益。
本实验室分离得到一株产紫杉烷类化合物的拟盘多毛孢属真菌Pestalotiopsis malicola,经HPLC、LC-MS、NMR验证其发酵产物中包括紫杉醇、10-DAB在内的多种紫杉烷衍生物。为了提高紫杉烷产量,本文采用化学诱变的方法对P.malicola进行诱变育种。实验以EMS作为诱变剂,摸索不同浓度下EMS对P.malicola的致死效果,并选取终浓度0.4M的EMS进行诱变育种。现已获得253株突变菌株,并且经HPLC检测,部分突变菌株次生代谢产物含量与野生型相比明显增多。我们对产紫杉烷衍生物含量增多的突变株进行单孢分离并多次传代培养,结果表明突变菌株性状遗传稳定。
本实验室通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的原生质体转化(ATMT)筛选得到一株产紫杉醇能力缺失的转化子Bu95。本文通过反向PCR和染色体步移方法对插入Bu95的T-DNA左侧翼序列进行了分析并测序。
本论文的另一项重要工作是对本实验室筛选的一株腐生真菌NK-36b进行细胞水平的遗传分析。NK-36b的次生代谢产物非常丰富,除紫杉烷类化合物外,其发酵产物中还含有大量的球毛壳甲素,产量高达83 mg/L。通过实验已证明该菌具有降解纤维素的能力,这些特殊的生物学功能让它在应用领域具有巨大的潜力。为了更好地对该菌株进行遗传和代谢分子机制研究,本实验完成了NK-36b的尿嘧啶营养缺陷型敲除载体的构建;并通过光学显微镜和电子显微镜分别对NK-36b菌丝和孢子的细胞形态及细胞核分布进行观察;同时对NK-36b的定向敲除基因Tdc1、Alb1进行PCR和Southern blot分析。