瑞氏综合征(Rett syndrome,RTT)是一种X染色体相关的神经系统紊乱性疾病。DNA甲基化结合蛋白2(MeCP2)基因突变被认为是导致RTT的原因。迄今为止关于MeCP2蛋白突变导致Rett综合症的具体机制尚不清楚,已有的MeCP2敲除小鼠的表型与RTT的病人的症状并不吻合。本研究通过构建MeCP2基因敲除大鼠模型,探讨MeCP2基因敲除大鼠和野生型之间转录组学的差异,并结合染色质免疫共沉淀的方法寻找MeCP2调控的靶基因,阐述了Rett syndrome产生的可能机制,为后续临床诊断和治疗提供理论支持。第一章:MeCP2基因敲除大鼠模型构建为构建类似人Rett syndrome的动物模型,本实验利用CRISPR-Cas9技术构建了靶向敲除MeCP2 exon2的载体。将该载体体外转录的Cas9 mRNA和sgRNA混合注射到SD大鼠受精卵中,用于获得MeCP2基因敲除大鼠模型,并对敲除大鼠可能出现的脱靶效应进行了评估。方法:通过构建MeCP2-sgRNA靶向敲除载体,并且体外转录Cas9 mRNA和sgRNA,显微注射到受精卵中,将受精卵移植到假孕的大鼠子宫中,对出生的大鼠的MeCP2基因进行测序验证,蛋白水平进行Western blotting验证。使用软件预测了可能的脱靶位点,并对脱靶位点进行了测序,检测是否存在脱靶位点。结果:成功构建了MeCP2基因敲除大鼠模型,将敲除打鼠MeCP2基因的测序结果和野生型进行比对,得到了两种不同基因型的MeCP2基因敲除大鼠。Western blotting验证两种基因型在蛋白水平均为阳性。在阳性敲除鼠中均未检测到脱靶位点。结论:本实验制备了MeCP2基因敲除大鼠模型,该模型在基因水平和蛋白水平均得到验证,为研究Rett综合症的发病机制提供了合适的动物模型。第二章MeCP2基因敲除大鼠行为学分析本章中对MeCP2基因敲除大鼠的行为学进行了分析,比较了敲除大鼠相对于同窝野生型大鼠的体重及表型变化,同时比较了MeCP2基因敲除大鼠与人Rett综合症患者的症状差异。期望通过上述研究,深入了解MeCP2蛋白缺失对大鼠脑神经发育过程的影响。方法:对出生大鼠的体重和表型进行了分析,并利用旷场实验和避暗实验对敲除大鼠的焦虑状况及学习认知能力进行检测,对所得的数据使用SPSS软件分析。结果:MeCP2基因敲除大鼠体重出现明显的下降,在旷场实验中,敲除大鼠在中心区域的活动偏多,呈现明显焦虑倾向;避暗实验中敲除大鼠错误次数明显增加,表明学习认知能力偏弱。结论:本实验表明MeCP2基因在大鼠脑神经发育过程中发挥着不可或缺的作用,并且MeCP2敲除大鼠的行为学表现与Rett综合症病人比较相近。第三章MeCP2基因敲除鼠转录组学及其调控的靶基因分析MeCP2基因在大鼠神经发育过程中起着至关重要的作用,MeCP2基因功能的缺失会导致下游基因的表达失调。通过研究MeCP2基因敲除大鼠转录组水平的变化并结合染色质免疫共沉淀来寻找MeCP2蛋白所调控的靶基因,阐述了 MeCP2导致Rettsyndrome可能机制。方法:本文利用RNA-Seq技术分析MeCP2基因敲除后RNA转录水平的变化,结合独特的抗体技术下的染色质免疫共沉淀(ChIP-Seq)方法,寻找MeCP2所调控的下游基因。结果:通过对ChIP-Seq数据及RNA-Seq数据的分析,MeCP2在不同脑区调控的基因存在明显的差异,这跟不同脑区的功能划分相关。研究发现MeCP2是一个全基因组内广泛结合的蛋白,且在大鼠的不同脑区(大脑、小脑和海马)中MeCP2蛋白倾向与长基因结合,并且更多地结合在基因的内含子区。结论:本研究找到了 MeCP2蛋白所调控的关键基因,及其结合DNA的motif。并且发现MeCP2蛋白可通过调控下游基因影响脑神经功能。