酶的定向进化能够取得成功的两个关键是建立多样性突变库的和有高效的筛选系统,本文中利用agaB在表达时可以水解琼脂糖的特性构建了一种高效率的组成型表达筛选载体,基于构建重组的原理利用共用接头互补重聚构建了一个大容量的基因文库。1.利用稳定性和转化效率高的pBluescript II KS (+)克隆载体质粒作为构建载体的母核,插入agaB启动子构建组成型表达载体,并利用pET-24a(+)上的酶切位点对表达载体上的酶切位点进行改造,再插入agaB基因构建组成型筛选载体。由于agaB基因表达时能在固体LB培养基上产生水解圈,双酶切后的载体连接目的片段在固体LB培养基上进行表达时,有水解圈的即为双酶切不完全的假阳性克隆,而没有水解圈的单克隆为连接了目的基因的阳性克隆。利用卡那霉素抗性基因检验筛选载体的效果。挑取16个无水解圈的菌落进行PCR特异性扩增后,经凝胶电泳鉴定有15个是阳性克隆,筛选效率达到90%以上,比传统载体筛选效率高很多,且不需要蓝白斑筛选,简化了实验步骤,减少了实验成本。2.大容量基因文库的构建:首先设计长度为21个碱基的两条随机序列,作为实验组合的基本模块,并在随机序列的两端分别设计九个碱基,这九个碱基顺向互补,作为一个通用的连接接头,在PCR重聚时相互作为引物。选用的九个碱基是可编码形成柔性氨基酸(linker)的碱基序列。随机序列中间的21个碱基是随机的,编码7个氨基酸,达到形成一个蛋白模序(motif)所需要的氨基酸数目。因此,随机序列通过PCR重聚就可以得到一个能够编码大量蛋白质的一个随机基因文库。在重聚过程中为了防止重聚片段过长,在重聚PCR达到一定的循环数后,在反应体系中加入一定比例的终止序列,由于终止序列是特异性的序列,在重聚延伸至此序列后,不再互补,重聚PCR反应终止,得到合适大小的基因片段。对反应体系和反应程序进行优化后确定最佳实验条件,然后利用常规分子生物学手段检验基因文库的多样性。利用生物信息学软件BioEdit对测序结果进行序列比较,通过比较结果可以看到基因文库中序列的差异性较大,并且片段之间的同源性较低,表示基因文库中基因序列的随机性较好。