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研究背景：反复着床失败(recurrent implantation failure, RIF)已成为阻碍妊娠率进一步提高的瓶颈问题,目前提高子宫内膜容受性的解决方法主要有宫腔搔刮、封闭抗体治疗、G-CSF及HCG宫腔灌注、针灸治疗仪等方法,但这些方法仍然存在疗效不确定等问题。PBMCs (peripheral blood mononuclear cells)是指外周血单个核细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞和单核细胞等,研究发现皮下注射丈夫或第三者外周血淋巴细胞主动免疫治疗能提高IVF-ET反复着床失败患者的妊娠率和活产率,但此方法具有需要多次注射、注射部位疼痛、血源性病毒感染及诱发母胎变态反应等副作用。因此,我们提出在着床前宫腔灌注自体PBMCs联合HCG用于反复着床障碍的患者其具有操作简单、一次完成、安全简便、无变态反应等优点。研究目的：从临床和实验方面探讨宫腔灌注外周血单个核细胞(PBMCs)对胚胎着床的影响及其机制,为临床上反复着床失败患者使用这一新的方法提供理论和实践依据。研究方法：第一部分(动物实验部分)：选择6-8周龄昆明小鼠,让雌雄小鼠同笼交配,将妊娠小鼠随机分成正常组、着床障碍组和着床障碍+PBMCs处理组三组。记录交配后第7.5天(Pd7.5)各组小鼠妊娠率和着床胚泡数,并采用免疫组化和Real Time-PCR技术观察各组小鼠着床窗期白血病抑制因子(LIF)和血管内皮生长因子(VEGF)的原位表达和其mRNA的表达。第二部分(细胞实验部分)：用Real Time-PCR方法检测在含或不含HCG的培养基中PBMC细胞的IL-1p和LIF mRNA的表达。将JAR细胞的培养基分为四组：对照组、仅HCG组、仅PBMCs组及PBMCs+HCG组。采用Transwell细胞侵袭实验检测各组对JAR细胞的增殖和侵袭力的影响。并用采用Western blotting方法检测JAR细胞中MMP2和MMP9的蛋白和其mRNA的表达。第三部分(临床实验部分)：将2013年9月到2014年3月在我院进行体外受精／单精子卵泡浆内注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)的反复着床失败患者,随机分成两组：对照组和宫腔灌注PBMCs处理组,比较两组的一般情况,受精情况和临床妊娠结局。实验结果：第一部分结果：与正常组相比,着床障碍模型组小鼠妊娠率和着床率显著降低(P<0.01),着床障碍--PBMCs处理组与模型组相比妊娠率和着床率升高(P<0.05)。着床障碍模型组着床窗期的LIF和VEGF的蛋白表达和mRNA表达较正常组有明显的降低(P<0.05),着床障碍+PBMCs处理组的表达与着床障碍模型组相比显著增加(P<0.05),接近正常组水平。第二部分细胞实验结果：HCG能促进PBMCs中IL-1p和LIF mRNA的表达。PBMCs+HCG组的侵袭细胞数均明显高于对照组,PBMCs+HCG组的MMP2和MMP9的蛋白和其mRNA的表达明显高于对照组,并且随着上清液的增加,其表达呈递增局势。第三部分临床试验结果：对照组和宫腔灌注PBMCs处理组两组之间的年龄、不孕年限、助孕方式、获卵数、2PN数、之前IVF次数、内膜厚度等均无统计学差异,宫腔灌注PBMCs处理组的着床率和临床妊娠率明显高于对照组,有统计学差异(P<0.05)。结论：1.着床前宫腔灌注未孕小鼠的外周血单个核细胞能增加着床障碍模型小鼠的着床率和临床妊娠率,其机理主要为增加着床窗期子宫内膜LIF和VEGF的表达来改善小鼠的子宫内膜容受性,从而提高妊娠率。2.HCG作为胚胎信号能能作用于PBMCs,使其分泌多种细胞因子,如IL-1β和LIF,这些细胞因子可增加滋养细胞的MMP-2和MMP-9的表达,以此来增强胚胎的侵袭能力。3.本中心初步的临床实践证明,对于反复着床失败患者在胚胎移植前给予宫腔灌注HCG处理过的PBMCs免疫治疗能显著提高患者的胚胎着床率和妊娠率。