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目的:光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)近年来主要应用于肿瘤治疗领域,其原理是通过系统性或局部应用光敏剂后,给予特定波长的光源照射,使光敏剂发生一系列的光化学反应,产生单线态氧,从而破坏细胞结构及功能继而杀伤靶细胞。光动力疗法的作用机制可能包括:一促进细胞凋亡或坏死;二损伤组织的供血血管;三影响局部或全身性的特异性或非特异性免疫反应。众所周知,银屑病的发病涉及相互影响的三个方面::角质形成细胞过度增殖、异常分化、炎症持续存在,Treg/Th17介导的免疫功能紊乱。银屑病中角质形成细胞的过度增殖被认为与肿瘤细胞的无限复制潜力相近似,因此近年来有很多学者尝试光动力疗法治疗局限性的斑块型银屑病,并取得了一定的临床疗效。同时发现,光动力疗法不仅可影响角质形成细胞的增殖分化和蛋白表达,对皮损局部和系统性免疫、炎症因子、细胞因子的合成分泌也有一定影响。但光动力疗法治疗银屑病的确切机制尚未明确,这方面的基础研究仍然很少。1960年Rothberg等发现银屑病皮损处特异性高表达角蛋白17,其表达程度与疾病严重程度密切相关,因此角蛋白17被称为“银屑病相关性细胞角蛋白”,以角蛋白17为靶点治疗银屑病也得到了一定的认可。临床中银屑病的经典治疗如阿维A,阿达木单抗等均可显著下调角蛋白17的表达。HaCat细胞被称为永生化的角质形成细胞,常被用做体外的银屑病研究模型。经过干扰素-γ的诱导,HaCat细胞可在体外过度表达角蛋白17,因此本研究尝试以干扰素-γ诱导的HaCat细胞作为研究对象,探讨5 a-氨基酮戊酸(5-aminolaevulinic acid,ALA)光动力疗法对HaCat细胞增殖,凋亡和角蛋白17表达的影响,进一步探讨光动力疗法治疗银屑病的可能分子机制,为光动力疗法治疗银屑病提供理论依据。方法:1.常规培养HaCat细胞,用250U/mL的TFN-γ刺激细胞48h,Real-time PCR法和Western-Blot法检测角蛋白17的mRNA和蛋白水平;2.用0、0.1、1、10 mmol/L浓度的ALA溶液孵育HaCat细胞4h后,635nm红光(70J/cm2)照射,MTT法检测细胞增殖活性,Real-time PCR法和Wester n-Blot法检测角蛋白17的mRNA和蛋白水平;3.用1 mmol/L ALA溶液和635nm红光(70J/cm2)干预IFN-γ诱导的HaCat细胞,孵育时间均为4h,干预后6,12,24,48h后MTT法分别检测细胞增殖活性;Real-time PCR法和Western-Blot法检测角蛋白17的mRNA和蛋白水平;4.用1 mmol/L ALA溶液,635nm红光(70J/cm2)分别和共同干预IFN-γ诱导的HaCat细胞,孵育时间均为4h,流式细胞仪检测细胞凋亡比例;5.Western-Blot法检测 1 mmol/L ALA-PDT干预前后HaCat细胞caspase3和P ARP蛋白的表达;6.Western-Blot法检测 1 mmol/L ALA-PDT干预前后HaCat细胞p-p38,p-ERK,p-JNK蛋白水平的变化;7.统计学分析 结果采用SPSS19.0统计软件进行数据分析。所有计数资料均取均数±标准差,多组均数的比较采用单因素方差分析,两组数据均数比较采用t检验,p<0.05为有显著性差异。结果::1用250u/ml IFN-y诱导HaCaT细胞48h后角蛋白17吸光度值为0.37±0.03,高于空白对照组(0.09±0.02),差异具有统计学意义(p<0.05);实验组角蛋白17的mRNA水平为3.07±0.13,高于空白对照组(1.00±0.04),差异具有统计学意义(p<0.05);2 0.1mM、1mM、10mM的ALA光动力疗法处理对IFN-γ诱导HaCat细胞增殖抑制率分别为20.28%、34.87%、44.37%,且在实验范围内抑制作用与ALA浓度成正相关;3 1mM ALA光动力疗法对IFN-γ诱导的HaCat细胞增殖抑制率在处理后6、12、24、48小时后分别为28.199%、34.86%、42.44%、50.88%,抑制作用在48小时内随时间逐渐增强;4 lmM ALA光动力疗法处理后HaCat细胞角蛋白17吸光度值为0.22±0.10,显著低于空白对照(0.67±0.04),单纯加入1mM ALA(0.63±0.04),单纯LED光源照射(70J/cm2)(0.47±0.15)(p<0.05);1mM光动力疗法处理后角蛋白17mRNA水平为0.50±0.01,显著低于空白对照(1.00±0.06),单纯加入lm M ALA(0.99±0.03),单纯LED光源照射(0.65±0.03)(p<0.05);5 lmM ALA光动力疗法处理IFN-γ诱导的HaCat细胞角蛋白17吸光度值在处理后6、12、24、48小时分别为0.62±0.04、0.41±0.03、0.28±0.03、0.11士0.03,显著低于空白对照0.70±0.02(p<0.05),抑制角蛋白17表达的作用在48小时内逐渐增强;6 lmM ALA光动力疗法处理后IFN-γ诱导HaCat细胞凋亡率为47.83%,显著高于对照组11.60%%p<0.05);光动力疗法处理后HaCat细胞caspase3,PAP蛋白吸光度值分别为0.36±0.02、0.49±0.07,显著高于对照组0.12±0.01、0.21±0.03(p<0.05);7 lmM ALA光动力疗法处理后HaCat细胞p-p38(0.47±0.05)显著高于处理前(0.12±0.02)、p-JNK(1.07±0.08)显著高于处理前(0.33±0.04)(p<0.05);而光动力疗法处理后p-ERK(0.17±0.03)降低(0.57±0.09)(p<0.05)。结论:ALA光动力疗法可显著抑制IFN-γ诱导的HaCat细胞增殖,促进其凋亡,这一作用可能通过激活p38,JNK信号传导通路实现;ALA光动力疗法对IFN-y诱导的HaCat细胞角蛋白17的高表达有显著抑制作用,且该作用与浓度和时间在一定范围内呈正相关。