牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)的宿主谱非常广,除了感染牛以外,还可引起猪、羊、鹿、骆驼和多种野生动物发病。该病的临床症状具有多种形式,包括牛病毒性腹泻-黏膜病、繁殖障碍、血小板减少与出血综合征、持续性感染、免疫耐受等。母畜在怀孕后30-120天内感染非致细胞病变型(noncytopathic,NCP) BVDV,由于此时胎儿的免疫系统尚未发育完全,不能免疫识别外源的NCP型BVDV,因此可造成胎儿死亡、产死胎和畸形胎等,存活的胎儿虽表现正常,但持续性感染BVDV并终身带毒,成为重要传染源。事实上,持续性感染是BVDV在环境中维持长期存在的重要原因之一。近年来,由于猪和感染BVDV的牛群直接或间接接触、给猪饲喂牛奶或牛下水、或接种污染BVDV的猪瘟疫苗等要素,使得猪群中BVDV感染率急剧升高。值得注意的是,猪瘟疫苗制备过程中使用的牛血清和细胞系也一定程度上增加了猪感染BVDV的风险。由于BVDV和猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)在血清学上有一定的交叉反应,因而在猪瘟检疫过程中,常常将BVDV感染误认为CSFV感染,而且猪感染BVDV表现出类似于猪瘟的临床症状,这不仅给猪瘟的预防和控制带来了困惑,也给BVDV感染的防控添加了新难题。目前,关于猪感染BVDV的防制并没有行之有效的方法和措施,欧美国家主要是使用疫苗接种,加强监测,淘汰持续性感染和免疫耐受的患病动物。在国内,猪群和牛群中的BVDV感染大多都是持续感染和免疫耐受等隐性感染,加上监测准确性限制和力度不够,各养殖场目前没有足够重视,疫苗防制存在效果不佳、安全隐患等关键环节,从而导致该病流行持续增加。因此,对于BVDV在猪群和牛群中防控工作,除了加强生物制品的生产、安全管理及养殖场的监测力度等,大量的基础研究工作尚需启动和进一步实施,一方面要了解目前猪群BVDV感染的流行、其流行株的遗传特性和演化趋势；另一方面基于牛源BVDV的研究基础,深入比较研究猪源BVDV和牛源BVDV的遗传特性及猪源BVDV感染的致病机理,为制定更有效的防控措施及研发BVDV新型疫苗奠定基础。本研究对临床送检的猪瘟疫苗和猪血样进行BVDV病原分离鉴定,为丰富猪源BVDV的分子遗传信息,我们选取其中一株猪源BVDV分离株进行了全基因组序列测定；基于病毒全基因序列已知信息,构建了猪源BVDV-2分离株的全长cDNA感染性克隆,为研究猪源BVDV基因组各基因的功能提供了有效工具和重要研究平台。为探析猪源BVDV逃逸细胞先天免疫和持续性感染机制,我们体外表达了猪源BVDV-2毒株的非结构蛋白Npro、NS2和NS3,探索它们在细胞抗病毒反应中可能发挥的作用,并利用建立的猪源BVDV-2cDNA感染性克隆平台,构建缺失编码非结构蛋白Npro的亚基因组感染性克隆并拯救缺失病毒,验证猪源BVDV-2非结构蛋白在细胞抗病毒反应中发挥的作用,为深入研究BVDV持续性感染机制奠定基础,从而有助于制定更有效的防制措施。主要研究内容分为以下4个部分：1.猪源BVDV病原的分离鉴定2010年,上海某猪场送检12份病猪血样和1份猪瘟疫苗(细胞源),经适当处理后将样品接种于MDBK细胞,同时设阳性对照和空白对照。72h后提取细胞总RNA,用针对BVDV5’非编码区(5’-untranslated region,5’-UTR)保守区域设计的FBVDVI-Ⅱ/RBVDVI-Ⅱ引物进行RT-PCR检测。结果表明,这12份病猪血样和1份猪瘟疫苗样品中均能扩增出约288bp的BVDV特异性条带。间接免疫荧光检测结果显示,这13个MDBK细胞分离株均能被BVDV-2单克隆抗体Bz-53特异性识别,发出绿色荧光；而不能与BVDV-1单克隆抗体D89反应。为了进一步确定送检样品中是否污染有BVDV,将这13个分离株的5’-UTR和E2基因分别克隆至pMD19T Simple Vector中,并送相关生物公司测序分析。根据BVDV分离株的5’UTR序列构建进化树,结果表明,这13个样品的确都感染有BVDV,而且这13个BVDV分离株均归属于BVDV-2亚型。将这13个BVDV分离株的E2基因进行同源性比对分析,发现它们之间的同源性均高于99.5%,说明它们很有可能来源于同一分离株,且该猪场的猪很可能是接种了污染有BVDV的猪瘟疫苗后才发病的。2.猪源BVDV-2分离株的全基因测序为进一步探析猪源BVDV-2的遗传分子特性,我们选取其中一株分离株SH-28进行全基因组序列的测定。提取SH-28总RNA,并反转录成cDNA;以此为DNA模板,将SH-28全长共分成18个片段进行PCR扩增,分别克隆于pGEM-T Simple载体并送生物公司测序,每个样品送3个克隆。其中,5’和3’末端序列的获得采用先环化RNA,然后用BVDV特异性下游引物反转录成cDNA,通过PCR扩增、克隆,并选取12个疑似阳性克隆进行测序分析。利用Lasergene软件进行序列的剪切和拼接,最终获得SH-28基因组序列全长为12,279个核苷酸(nt),开放阅读框(ORF)长11685nt,编码3895个氨基酸(aa),5’-UTR和3’-UTR分别长385nt和206nt。构建全基因组遗传进化树分析表明,SH-28与HLJ-10(分离自牛血清,BVDV-2)同处于一个分支上,与XJ-04(牛源BVDV-2)的全基因组核苷酸同源性最高(92.3%),而与另外两株猪源BVDV-1(ZM-95和SD0803)的亲缘性较远(70.0%、70.1%)。根据5’-UTR序列构建进化树,发现SH-28分离株属于BVDV-2a2基因亚型,而HLJ-10和XJ-04株属于BVDV-2a1。由此,我们推测该猪源BVDV-2分离株SH-28很有可能是由牛源BVDV-2进化而来的,但不完全同于已发表的BVDV-2分离株序列。3.猪源BVDV-2分离株cDNA感染性克隆的构建及病毒拯救为深入研究猪源BVDV基因组各基因的功能及其致病机理等,本研究构建了猪源BVDV-2分离株SH-28全长cDNA感染性克隆并在MDBK细胞上成功拯救病毒。将SH-28全基因组共分成9个片段,经适当的限制性内切酶分析和DNA片段连接策略将其全长cDNA克隆至低拷贝载体pACYC184中,同时利用PCR技术在其基因组5’端和3’端分别引入T7启动子序列和单一SbfI酶切位点序列,构建出全长cDNA质粒pASH28。质粒经SbfI线性化后,利用T7MEGAscriptkit将其体外转录成基因组RNA,然后用Lipofectamine LTX and PlusTM Reagent将RNA转染MDBK细胞,连续传代培养直至第十代。间接免疫荧光检测和RT-PCR鉴定结果表明vASH病毒拯救成功且其遗传特性稳定,证实我们成功建立了猪源BVDV-2感染性克隆平台。在此基础上,我们利用重叠延伸PCR方法将pASH28基因组中的Npro基因进行缺失,构建了缺失Npro基因的亚基因组感染性克隆pASH⊿Npro并拯救出缺失病毒pASH⊿Npro。比较vASH、vASH⊿Npro和亲本病毒SH-28的病毒滴度增长趋势,发现三者都具有良好的生长特性,且vASH和亲本病毒SH-28的病毒滴度增长趋势一致,而缺失病毒vASH⊿Npro的病毒滴度增长速度要低于vASH和SH-28,这可能是由于Npro基因的缺失而间接造成的。本研究中vASH⊿Npro缺失病毒的成功拯救不仅证实了猪源BVDV-2感染性克隆平台的有效性,也为下一步研究Npro基因的功能奠定了平台基础。4.猪源BVDV-2非结构蛋白的功能探析探析猪源BVDV-2非结构蛋白在病毒逃逸细胞先天免疫中的作用,旨在为BVDV持续性感染机制的研究提供线索。根据猪源BVDV-2分离株SH-28的全基因组序列,针对Npro、NS2和NS3基因分别设计1对引物,PCR扩增各基因并将其克隆入pEGFP-N1真核表达载体中,构建重组真核表达质粒pEGFP-Npro、 pEGFP-NS2和pEGFP-NS3。经瞬时转染和Western blot鉴定,证实真核表达载体中GFP标签与非结构蛋白Npro、NS2和NS3均融合表达成功。研究发现,感染猪源BVDV-2分离株SH-28或体外表达其非结构蛋白Npro均可抑制由poly(IC)诱导产生的IFN-I的表达,而体外表达NS2或NS3对IFN-I的表达没有明显变化,由此推测Npro可能在猪源BVDV-2干扰细胞先天免疫中发挥重要作用。利用荧光定量PCR进一步检测非结构蛋白对抗病毒蛋白表达的影响,发现过量表达非结构蛋白Npro使抗病毒蛋白ISG15、OAS和Mx1的表达显著下降(P≤0.05),但PCR的表达没有明显变化；而过量表达非结构蛋白NS2或NS3对这4种抗病毒蛋白的表达均没有显著影响。将缺失Npro基因的vASH⊿Npro病毒感染MDBK细胞,检测Npro蛋白在细胞抗病毒反应中的作用。结果表明,缺失表达Npro蛋白可显著上调MDBK细胞内抗病毒蛋白ISG15、OAS和Mx1的表达(P≤0.05),而PKR的表达仍无明显变化。这从整体水平上验证了非结构蛋白Npro可通过OAS和Mx1两条途径,及与ISG15蛋白相互作用,从而拮抗细胞抗病毒反应及协助猪源BVDV-2逃逸细胞先天免疫,为持续性感染机制的研究奠定了基础。