背景及目的：　　 人羊膜组织产后常被丢弃,作为“废物”利用,是再生医学和干细胞治疗的良好资源。与骨髓间充质干细胞类似,从羊膜中分离的间充质干细胞具有很好的免疫耐受性,适用于异体干细胞移植,也是干细胞研究的良好对象。　　 细胞迁移在体内组织、器官再生和分化过程中非常重要,因此研究人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)如何在适当时间迁移到适当部位,在再生医学和干细胞治疗中非常必要。表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)在多种类型细胞迁移和增殖中发挥作用,促进上皮细胞、成纤维细胞、角质形成细胞和平滑肌细胞迁移;创伤组织产生的EGF能明显促进创伤愈合。另外,EGF价格低,可以大量生产,且在多种情况下都能保持稳定,所以我们选择EGFR信号通路作为研究对象。有报道EGF能促进大鼠和永生化人骨髓间充质干细胞迁移,而在hAMSCs增殖和迁移中的作用未见报道。　　 细胞应答外界信号分子向特定方向迁移是一个复杂的过程,需要前端和后部在时空方向上获得不对称性。尽管调控MSC迁移的分子研究很多,但对迁移方向的调控机制认识较少。由于伤口成功修复需要MSC在确切时间迁移到确切位置,因此研究干细胞定向迁移(directional migration)对于创伤修复具有重要意义。　　 小鼠胚胎干细胞中EGFR.激活可引起下游PI3K/AKT活化,ERK信号通路是EGFR调控的另一条通路,与细胞增殖和迁移有关。我们将检测EGF是否能引起体外培养hAMSCs的定向迁移,探索EGF通过EGFR信号通路促进hAMSCs定向迁移的机制。体外扩增并增强hAMSCs迁移能力能增加体内治疗干细胞数量及细胞迁移到损伤组织的能力,有助于提高治疗效果。　　 方法：　　 1、细胞培养　　 酶消化法体外分离hAMSCs,制成单细胞悬液后,以一定细胞密度接种于培养瓶内,置于37℃体积分数为5%的CO2培养箱中培养。　　 2、免疫细胞化学　　 免疫细胞化学检测干细胞表面标志,进行波形蛋白、CD44、CD90、PAK1等染色。　　 3、检测细胞增殖　　 MTT法检测EGF对hAMSCs增殖的作用,及EGFR抑制剂AGl478、P13K抑制剂LY294002、ERK抑制剂U0126对EGF作用的影响。　　 4、检测细胞迁移　　 划痕实验观察不同浓度EGF对hAMSCs迁移的影响;Transwell小室测定EGF对hAMSCs迁移的作用,及EGFR抑制剂AG1478、PI3K抑制剂LY294002、ERK抑制剂U0126对EGF作用的影响;Dunn chamber法观察EGF浓度梯度对hAMSCs定向迁移的影响。　　 5、Western-blot　　 Western-blot检测EGF处理后EGFR、AKT、ERK的磷酸化水平的变化,分析其与细胞迁移的关系。　　 结果：　　 1、细胞培养　　 体外分离的hAMSCs生长状况良好,接种六七天融合度达90%以上,细胞呈放射状或漩涡状排列.传至3代后呈均匀梭形。　　 2、免疫染色　　 免疫细胞化学结果显示,本实验分离获得的目标细胞表达间充质细胞标志波形蛋白、CD90、CD44,不表达CD14、CD45。　　 3、检测细胞增殖　　 MTT结果显示,不同浓度EGF对hAMSCs增殖起到不同程度的促进作用。而EGF对细胞增殖的作用被AG1478、LY294002和U0126抑制。　　 4、检测细胞迁移　　 划痕实验结果显示,EGF浓度为100ng/ml时对细胞迁移的促进作用最明显。Transwell结果显示EGF促进hAMSCs迁移,AG1478、LY294002和U0126作用后,迁移细胞数与EGF组相比明显减少。Dunnchamber结果显示EGF浓度梯度能引起hAMSCs定向迁移。　　 5、Western-blot　　 Western blot结果显示,EGF对hAMSCs作用过程中存在EGFR和P13K/AKT及ERK1/2的短暂激活。　　 结论：　　 本研究发现,EGF通过激活EGFR其下游的PI3K/AKT和ERK1/2信号通路促进hAMSCs的EGF高浓度方向定向迁移,但EGF启动hAMSCs定向迁移的具体机制还有待进一步研究。EGF可激活PAK1表达,因此PAK1可能参与hAMSCs的定向迁移。表达谱分析发现的显著差异表达基因MMP-2和AQP1可能与hAMSCs的定向迁移密切相关。