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鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)是一种临床上能够引起雏鸡再生障碍性贫血和全身淋巴组织萎缩为主要特征的鸡传染性贫血(Chicken infectious anemia,CIA)的病原体。CIAV会攻击鸡的免疫系统,不仅会引起其他病原继发感染,还会干扰重大疫病的免疫效果。该病可垂直传播,通过对种鸡进行抗体监测,及时发现并淘汰患病种鸡对于该病的防控至关重要。国外的商品化CIAV ELISA抗体检测试剂盒,价格昂贵,用于该病的抗体检测成本太高,而国内还没有相关的商品化检测产品。因此,本论文以CIAV的衣壳蛋白VP1为抗原,建立了一个特异性、敏感性、重复性较好的CIAV间接ELISA抗体检测方法,希望能够为CIAV的抗体检测和疫病净化提供一个重要工具。主要研究内容如下:1、利用杆状病毒表达系统表达重组VP1蛋白将构建好的含有VP1基因的转移质粒和杆状病毒基因组共转染sf 9细胞,以产生携带有VP1基因的重组杆状病毒,命名为BAC-VP1。通过光学显微镜可以观察到转染细胞相较于正常细胞而言,细胞体积变大,膨胀,初步判断细胞转染后形成了重组杆状病毒。提取感染重组毒的细胞基因组并用鉴定引物进行PCR扩增,PCR扩增产物经核酸电泳检测到相应的目的条带,进一步确定重组杆状病毒BAC-VP1构建成功。收获感染BAC-VP1的细胞后制样,进行Western Blot分析,结果显示,在预测的重组VP1蛋白大小附近,没有检测到相应的条带,说明没有成功表达重组VP1蛋白。2、利用原核表达系统表达重组VP1蛋白进一步用大肠杆菌表达系统实现重组VP1蛋白的表达。根据实验室前期分离到的CIAV基因序列并结合大肠杆菌密码子偏爱性分析,合成了衣壳蛋白VP1的编码序列。分别将截短的重组VP1(40～449aa)蛋白和重组VP1(78～449aa)蛋白表达质粒转化BL21菌株,经IPTG诱导后,SDS-PAGE结果显示成功表达重组VP1(40～449aa)蛋白和重组VP1(78～449aa)蛋白,但是均以不溶性的包涵体形式存在。为了实现重组VP1蛋白的可溶性表达,先后尝试用重组VP2蛋白和5种不同的分子伴侣帮助其正确折叠,最终利用3号分子伴侣(dna K-dan J-grp E)成功实现了重组VP1(40～449aa)蛋白的可溶性表达,利用5号分子伴侣(dna K-dan J-grp E/gro ES-gro EL-tig)成功实现了重组VP1(78～449aa)蛋白的可溶性表达。3、纯化原核表达的重组VP1蛋白利用Ni-NTA亲和层析柱分别对大肠杆菌表达的重组VP1(40～449aa)蛋白和重组VP1(78～449aa)蛋白进行纯化,洗脱后的样品分别用SDS-PAGE分析,结果显示重组VP1(40～449aa)蛋白没有挂上Ni-NTA亲和层析柱,洗脱的样品中没有目的蛋白;而重组VP1(78～449aa)蛋白在300mmol/L咪唑浓度洗脱下,洗脱液中重组VP1蛋白的浓度较高,纯度较好,说明试验成功纯化出重组VP1(78～449aa)蛋白。4、以原核表达的重组VP1蛋白为抗原的CIAV间接ELISA抗体检测方法的建立以纯化后的原核表达重组VP1(78～449aa)蛋白为检测抗原,旨在建立一种CIAV间接ELISA抗体检测方法。通过对抗原包被浓度、血清稀释倍数、包被条件、封闭时间及酶标抗体稀释倍数进行优化,最终确定CIAV间接ELISA抗体检测方法的最佳反应条件:抗原包被浓度为16μg/m L;血清稀释倍数为1:80;包被条件为4℃包被过夜;封闭时间为37℃下封闭2h;酶标抗体稀释倍数为1:10 000。用该方法对30份CIAV阴性血清进行检测,确定该方法的阴阳临界值为0.285。用建立的CIAV间接ELISA抗体检测方法检测AIV、NDV、MDV和IBDV的病原阳性血清时均为阴性,表明该方法的特异性较好;用该方法和IDEXX的CIAV ELISA抗体检测试剂盒同时对不同稀释倍数的CIAV阳性血清进行检测,该方法的最低检测稀释度为1:512,而IDEXX的CIAV ELISA抗体检测试剂盒的最低检测稀释度为1:256,说明该方法的敏感性较好;重复性试验显示批内和批间变异系数均小于10%。应用该方法和IDEXX的CIAV ELISA抗体检测试剂盒同时对90份临床血清进行检测并计算它们之间的符合率,结果显示,IDEXX的CIAV ELISA抗体检测试剂盒检出阳性样本数为50份,其中45份由本方法检出为阳性,阳性样品的符合率为90%;IDEXX的CIAV ELISA抗体检测试剂盒检出阴性样本数为40份,其中32份由本方法检出为阴性,阴性样品的符合率为80%,总符合率为85%。