研究背景哮喘是一种发病机制十分复杂的常见疾病,涉及多种细胞及细胞因子的共同参与,目前认为哮喘的病理生理过程主要有气道高反应性,气道炎症,粘液细胞的过度分泌,气道重塑等,其中气道重塑是固定性气流受限、肺功能受损的病理生理基础。哮喘一直被认为是Th2疾病,这种疾病是由Th2细胞因子水平升高而引起IgE和嗜酸性粒细胞增加的炎症反应。机体吸入致敏原后刺激机体产生抗原,抗原被抗原提呈细胞树突状细胞捕获,随后被提呈给辅助T(Th)细胞,激活Th2细胞扩增,随之Th2细胞因子如白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5) 、白介素13(IL-13)等产生并释放从而诱发气道炎症。另外已知Th-17细胞、Th-19细胞及其分泌的多种炎性因子如：白介素17A(IL-17A)、白介素17F(IL-17F)、白介素22(IL-22)和白介素19(IL-19)也参与哮喘的调节。这些炎症因子也诱导炎症形成,促进气道平滑肌的收缩,诱发哮喘。气道重塑是哮喘的另一重要病理生理特征,反复气道炎症破坏气道上皮组织,而破坏了的上皮细胞进行修复,从而形成了损伤修复的循环。处于修复阶段的上皮细胞产生促纤维介质及炎前性细胞因子。促纤维介质包括生长因子-β(TGF-p)、纤维生长因子、内皮素,这些促纤维介质可调节纤维母细胞、肌成纤维细胞分泌胶原、弹性纤维、蛋白多糖、糖蛋白,从而引起气道壁增厚。肌成纤维细胞分泌的Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ胶原蛋白、纤连蛋白(FN)、细胞粘合素也促进气道壁的增厚。TGF-β1、介导肺泡上皮细胞向间充质细胞转化(epithelial to mesenchymal transition, EMT),通过EMT促进气道重塑的发展,在这一过程中嗜酸性粒细胞、肥大细胞也起重要作用。促炎性细胞因子白介素25(IL-25)、白介素33(IL-33)等刺激基质增殖导致也加重了气道重塑的形成,气道重塑过程中α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)和胶原表达增加,其中FN、α-SMA被看做是气道重塑的标记。白介素20(IL-20)是于2001年新发现的一种细胞因子,激活的单核细胞是IL-20的主要来源,IL-20的其他来源包括皮肤胶质细胞、内皮细胞、风湿性滑膜炎的成纤维细胞等。IL-20基因在人类编码在1q32,长度为195kb,属于白介素10(1L-10)细胞因子家族,与白介素24(IL-24) 和IL-19结构最相似,另外IL-20和IL-24受体具有IL-20R的两种类型,而IL-19与IL-20具有相同的IL-20R1,因此IL-20、IL-24、IL-19构成IL-10家族中的一个亚群。IL-20通过JAK家族的胞质酪氨酸激酶来进行信号转导的,JAKs能够激活信号传导及转录激活因子3(STAT3),最终启动转录。与IL-10家族其他细胞因子是抑炎型细胞因子不同,IL-20是促炎性细胞因子,尤其是在炎症早期发挥重要作用。在牛皮癣患者皮损斑块中、风湿性关节炎滑液中、结肠炎粘膜上皮中均发现高水平表达IL-20,说明IL-20在上述疾病的发生发展过程中其重要作用。但目前仍未发现IL-20在支气管哮喘炎症发生发展及气道重塑中作用的研究报道。根据国内外该领域的研究,目前仍未解决的问题有：(1)IL-20及其受体是否在支气管哮喘气道上皮中表达增高,是否与哮喘的严重程度相关；(2)IL-20的表达是否与支气管哮喘的Th2免疫应答有关；(3)IL-20在支气管哮喘气道重塑中是否发挥作用。研究目的1. 明确IL-20及其受体在支气管哮喘上皮细胞及肺泡灌洗液中的表达水平,以及其表达水平是否与哮喘严重程度相关；2. 探讨IL-20在支气管哮喘中的作用及IL-20与Th2免疫应答的相关性；3. 探讨IL-20在支气管哮喘气道重塑中是否发挥促进气道重塑的作用。研究方法1. 首先为了明确IL-20及其受体在气道上皮是否高水平表达,我们从支气管哮喘患者(n=20)和正常人(n=20)分别获取支气管镜活检标本,并用特异性抗体分别对IL-20、IL-20受体1(IL-20R1)、IL-20受体2(IL-20R2)进行免疫组织化学染色。2.其次为了研究IL-20在支气管哮喘中与Th2免疫应答的关系,首先我们采集哮喘患者(n=100)和正常人(n=100)静脉血血清,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测受试者血清中IL-20与IL-4、IL-5、IL-13的水平,并分别进行IL-20与IL-4、IL-5、IL-13的相关性分析,同时,我们将哮喘患者分为轻、中、重三组,分析三组患者血清中IL-20表达水平是否有差异,以明确IL-20的表达水平是否与哮喘严重程度有关。3.再次我们采用苏木精-伊红染色法(HE)染色观察支气管哮喘患者气道黏膜上皮的气道重塑情况。为了明确IL-20在支气管哮喘气道重塑中的作用,我们首先将20只BALB/c小鼠随机分为鸡卵白蛋白(OVA)组和对照组,每组10只,OVA组制作小鼠哮喘模型,取两组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF),应用ELISA检测BALF中IL-20表达水平,然后应用免疫组织化学染色技术检测哮喘模型小鼠气道上皮中IL-20、IL-20R1、IL-20R2、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤连蛋白-1(FN-1)的在气道上皮的表达水平。为明确哮喘模型小鼠肺组织中IL-20、IL-20R1、IL-20R2、α-SMA、FN-1是否高于正常对照组,我们应用western blot方法对哮喘模型小鼠肺组织在蛋白质水平上检测IL-20、IL-20R1、IL-20R2、α-SMA、FN-1的表达情况。为进一步明确IL-20与α-SMA、FN-1有无直接关系,我们采用细胞培养进行体外试验,采用小鼠肺上皮细胞-12(MLE-12)细胞进行细胞培养,用IL-20处理MLE-12细胞,IL-20浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0ng/ml,应用western blot方法检测各浓度IL-20处理后的α-SMA、FN-1表达水平,并应用western blot方法检测1.5ng/ml浓度的IL-20处理MLE-12细胞0、6、12、24h时α-SMA、FN-1以确定α-SMA、FN-1与IL-20有无剂量、时间依赖性,为进一步确定IL-20与α-SMA、FN-1之间有无因果关系,我们应用细胞转染技术,采用IL-20-shRNA转染MLE-12沉默IL-20的表达,采用western blot方法检测IL-20、α-SMA、FN-1表达情况。研究结果1.首先通过对哮喘患者气道黏膜活检组织进行免疫组织化学染色的方法,我们发现支气管哮喘患者气道粘膜上皮中IL-20、IL-20R1、IL-20R2的表达较对照组明显升高(分别为：P<0.01,P<0.01,P<0.01),具有显著的统计学差异。2.通过ELSIA方法检测我们检测支气管哮喘患者及健康对照血清中IL-20与IL-4、IL-5、IL-13,结果发现支气管哮喘患者血清中IL-20与IL-4、IL-5IL-13具明显高于健康对照组(分别为：P<0.001,P<0.01,P<0.001,P<0.001),同时我们将IL-20水平与IL-4、IL-5、IL-13水平进行了相关性分析,结果发现,IL-20水平的升高与IL-4、IL-5、IL-13水平的升高具有显著的正相关性(相关系数R2分别为：0.809,0.783,0.752)。我们将100名哮喘患者分为轻、中、重三组,分析这三组患者血清中IL-20的水平有无差异,结果发现随着患者病情严重程度的加重,患者血清中IL-20的水平逐渐升高,且三组中IL-20的表达水平与对照组及相互之间有明显差异(分别为：P<0.01,P<0.05,P<0.05,P<0.05)。3.通过HE染色,我们在哮喘患者气道粘膜上皮中发现了明显的气道重塑的病理表现。在小鼠BALF的研究中,我们发现与对照组小鼠BALF相比,哮喘模型小鼠BALF中IL-20的表达水平明显升高(P<0.01),具有统计学意义。我们应用免疫组织化学染色染色发现哮喘模型小鼠气道上皮中IL-20、IL-20R1、IL-20R2、α-SMA、FN-1的表达明显高于对照组(分别为：P<0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.05)。通过western blot方法进一步确定了哮喘模型小鼠肺组织中IL-20、IL-20R1、IL-20R2、α-SMA、FN-1的表达水平明显高于对照组(分别为：P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01),均有统计学差异。IL-20处理MLE-12细胞后发现α-SMA、FN-1的表达水平明显上调,并且发现α-SMA、FN-1的表达水平随IL-20的浓度的增加而明显上调,IL-20在1.5ng/ml浓度与MLE-12细胞共育6小时后,α-SMA、FN-1表达水平升高。应用IL-20-shRNA沉默IL-20的表达,再次应用western blot检测α-SMA、FN-1,结果发现α-SMA、FN-1的表达水平被明显抑制了。研究结论1.支气管哮喘患者气道黏膜上皮IL-20、IL-20R1、IL-20R2高表达。哮喘模型小鼠BALF中高表达IL-20。2.哮喘患者血清中高表达IL-20与IL-4、IL-5、IL-13,且IL-20的升高与IL-4、IL-5、IL-13的升高呈正相关。说明IL-20与Th2免疫应答存在明显的正相关关系。3. 支气管哮喘模型小鼠肺组织及气道上皮中IL-20、IL-20R1、IL-20R2、α-SMA、FN-1高表达及HE染色均支持哮喘气道上皮存在气道重塑。应用western blot方法进一步确定鼠肺组织中IL-20、IL-20R1、IL-20R2、α-SMA、FN-1的表达水平明显高于正常对照组。用IL-20处理MLE-12细胞后发现α-SMA、FN-1表达升高,并且其升高与IL-20浓度存在剂量依赖关系及时间依赖关系。沉默IL-20后,我们发现α-SMA、FN-1的表达明显被抑制,说明IL-20在支气管哮喘气道重塑中起重要作用,提示抑制IL-20的表达可能是改善哮喘气道重塑的一个有效的治疗靶点。