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甲基化是研究最为深入的表观遗传学机制。该机制的异化可导致基因表达的异常及基因组稳定性的降低，继而促进肿瘤发生和发展。启动子CpG岛的高甲基化已被认为是与遗传性缺陷同等重要的、造成抑癌基因在肿瘤中失活的分子生物学机制。我们早期的实验使用甲基特异性PCR(methylation specific PCR，MSP)检测膀胱肿瘤RASSF1A基因甲基化，虽然表明两者存在一定关联，但临床诊断意义不高。本研究拟从以下两个方面探索提高膀胱肿瘤标本RASSF1A基因甲基化临床诊断意义的途径。一，改变退火温度对甲基特异性PCR检验指标有效性的影响。目的：探讨改变退火温度对甲基特异性PCR检验指标有效性及诊断意义的影响。方法：将经测序证实的RASSF1A完全甲基化标本作为100％M标本，完全未甲基化标本作为O％M标本，按1∶3体积比例混合，作梯度PCR扩增，摸索适当的退火温度。选取单一电泳条带的温度为优化的退火温度，并以这些温度检测70例标本(35对，以同一病人的肿瘤组织K、癌旁组织N为一对)，比较其在各温度情况时的扩增效果。结果：70岁以下组60.7℃阴性似然比0、阴性预测值1.00、诊断灵敏度1.00、ROC曲线面积值0.750；而文献使用温度64.0℃阴性似然比0.8、阴性预测值0.56、诊断灵敏度0.33、ROC曲线面积值0.583；70岁以上组60.7℃阴性似然比0.67、阴性预测值0.60、ROC曲线面积值0.529。其余各指标无统计学差异。结论：应用MSP检测RASSF1A甲基化可以作为膀胱肿瘤早期诊断的辅助方法，较低年龄组的应用价值大于高年龄组，尤其是在排除肿瘤方面。临床肿瘤标本具有相当的复杂性，使用各种方法检测临床标本要充分考虑到各种生物学因素(如：年龄等)的影响。在应用MSP检测临床肿瘤标本时，可根据不同年龄段调整退火温度，以提高检验指标的有效性及诊断价值。二，应用McMSP分析RASSFlA启动子区域甲基化。目的：应用McMSP分析RASSF1A启动子区域甲基化状况，探索McMSP定量检测甲基化的可行性、灵敏度、诊断价值，并简化操作流程，降低成本。方法：先对已行常规甲基特异性PCR(MSP)扩增后的产物进行熔解曲线分析(Melting Curve Anlysis，MCA)；然后将荧光素SYBR GreenⅠ直接加入PCR反应前体系进行扩增(即McMSP)；探索McMSP分析的灵敏度：将标本按1：10，1：100，1：500，1：1000，1：5000，1：10000稀释后，分别行MSP和McMSP。结果：(1)没有应用商业试剂盒，同时将文献报道的SYBR GreenⅠ浓度降低至10000×，仍能获得满意的结果；(2)常规MSP标本1：100稀释(DNA量＞100pg)时就已检测不到目的产物，而该法在DNA 1：10000稀释后(DNA量＜2pg)，仍可以检测到所需要的目的产物；(3)McMSPROC曲线分析，70岁以下组、70岁以上组及所有标本Tm cut-off值分别为62.525、63.535、62.935；ROC面积值分别为0.846、0.750、0.819。结论：利用实时荧光定量PCR熔解曲线分析法检测RASSFlA启动子区域甲基化迅速准确，操作简便，成本低廉，结果直观，并具有较常规MSP更高的灵敏度和诊断价值。三，本实验还检测了膀胱肿瘤RASSF1A家族基因RASSF2A、NORE1A甲基化状况及RASSF1A的蛋白质表达水平。目的：在已完成膀胱肿瘤RASSF1A基因甲基化检测的基础上，对RASSF基因家族的甲基化状况做初步筛查，并在蛋白质层面探讨RASSF1A DNA甲基化与基因表达的关系；方法：采用MSP技术检测54例膀胱癌组织及其相应癌周正常组织RASSF2A、NORE1A基因启动子甲基化状态；用免疫组织化学方法检测18例膀胱正常组织及38例膀胱移行上皮癌(TCC)组织中RASSF1A基因的表达情况，并与临床特征相比较；结果：(1)RASSF2A检出率仅为2／54，NORElA仅为0／54；(2)相应癌周正常组织和3例正常膀胱组织均未发现该基因高甲基化改变；(3)甲基化状态与膀胱癌临床病理参数无明显相关性；(4)RASSF1A在膀胱TCC和正常组织中的蛋白质表达阳性率分别为39％和83％；将免疫组化结果判读为(-)者与对应DNA甲基化、mRNA表达两个指标对照，相应标本分别有83.3％(20／24)存在DNA甲基化，79.2％(19／24)存在mRNA表达下调。结论：在膀胱癌中，RASSF2A、NORElA在膀胱肿瘤中的甲基化率较低，并不适合进行临床筛查。RASSF1A的表达与膀胱移行细胞癌的发生发展密切相关。膀胱肿瘤RASSF1A蛋白质表达与其DNA甲基化、mRNA表达下调密切相关。