前言 恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病。在我国每年至少有160万新增癌症患者，而且每年约有130万人死于癌症，随着人口数量的增加和人口老龄化的加快，肿瘤发病率和死亡率也呈上升趋势。因此肿瘤的防治工作一直是我国医药卫生领域的重点，寻找安全有效的药物是肿瘤治疗中的重要课题。近年来动物来源药物越来越受重视，充分利用我国动物资源开发新的抗肿瘤药物，成为肿瘤研究领域的重要内容。迄今关于蛇毒神经生长因子抑瘤作用，国内尚未见报道。 蛇毒神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是由蛇毒精制而成单一成分的生物制剂。国外已有报道许多体内外实验均表明，NGF对肿瘤的生长具有抑制作用，但其确切抑瘤机制尚在研究中。 内皮素(endothelin，ET)是由血管内皮细胞等合成的一种活性多肽，是迄今为止所发现的最强的缩血管物质。ET作为生长因子能够以旁分泌和自分泌作用刺激癌细胞的异常增生，与肿瘤的发生、发展有关。但NGF对小鼠H22抑制作用如何，这一作用与ET之间是否存在联系，尚待深入研究。 为此，本研究首先筛选分离出长白山地区白眉蝮蛇毒的抗肿瘤成分，并对其体外、体内抗肿瘤作用及可能的机制加以研究。 目的 1、筛选并探讨长白山地区白眉蝮蛇(Agkstrodon halys ussuriensis)毒抗肿瘤成分。 2、探讨蛇毒神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)对体外培养人肿瘤细胞增殖的抑制作用。 3、探讨神经生长因子(NGF)对小鼠腹水瘤1122的抑制作用以及与血浆内皮素含量的相关关系。方法 1、经cMc一sephaxose即、Sephac水S-2oo等层析法从长白山地区产白眉蝮蛇毒中分离纯化获得抗肿瘤成分，通过检测发现该成分为神经生长因子(NGF)。 2、采用唾哇蓝(MTr)法、台盼蓝拒染法和集落形成作为观察指标，以NGF(5、10、15、20林岁祖)处理4种人肿瘤细胞(人白血病细胞株隔、人胰癌细胞株Jn05、人肺癌的胞株AGZY名3a和人胃癌细胞株MG名03)，选用不同作用时间，分别观察NGF对上述细胞的影响。阿霉素(DXR)为阳性对照药。 3、用不同剂量(5、10、20林g/kg)的NGF对荷腹水瘤H22小鼠进行治疗，观察其对小鼠腹水瘤H22的影响。 4、各组小鼠皮下接种1122细胞，治疗方法同前。利用放射免疫测定法(班A)测定荷瘤小鼠血浆内皮素(ET)含量，观察NGF对ET含量的影响。结果 1、实验证实抗肿瘤成分为NGF，经SDS一以GE实验，证实NGF分子量为16.SKD，对小鼠腹水瘤H22有抑制作用，能使荷瘤小鼠生命延长率提高达62.2%。 2、NGF对K562、J”05.、AGzY名3a和MG名03细胞均有细胞毒性作用，凡62和J邪05比后两者显示出更好的量效关系(r二0.9726，r二0.9768，P<0.05)。NGF处理K弱2和JF305细胞24h，48h和%h后，两种细胞的生长均受到抑制(P< 0.05，P<0.01)并有显著的剂量效应关系，处理J邪05细胞24h、48h和96h，NGF的IC，分别是17.89林岁Inl、10.60卜扩ml和13.42林岁血，时间一效应关系亦明显;处理K翔细胞的Ic，分别是.18.25林g/d、9.10林g/耐和14.36林g/d，NGF对K魏细胞的生长抑制作用以48小时为显著。另外NGF还可显著抑制Jn05细胞的集落形成，并有明显的量效关系(r=0 .9869，p<0.01)，其IC，为12.86林岁ml。 3、NGF大剂量组对小鼠腹水瘤H22有明显的抑制作用(抑瘤率46.36%)。荷H22腹水瘤小鼠ET水平明显高于对照组(P<0.05)，大剂量组小鼠血浆ET含量明显降低(P<0.05)。讨论 在抗肿瘤药物筛选和研究中，体外肿瘤细胞培养和动物实验居重要地位，采用体外细胞培养方法筛选抗肿瘤药物时，检测的终点指标包括细胞的生存能力检测和生长能力测定两个方面，前者的检测常采用MTT法，后者的检测常采用集落形成能力实验，细胞计数，蛋白质或其它大分子物质含量测定等。两者结合能客观地反应被测物质的药理作用。MTr法是一种快速、简便的颜色反应的测定方法。哺乳类动物细胞的线粒体内唬拍酸脱氢酶可将黄绿色的M竹降解成蓝紫色的甲攒(fo~)，应用酶联免疫检测仪测定甲脸的含量，可以定量测定细胞存活的比例，1983年Mos~等首次将M竹原理应用于免疫法的细胞毒性测定。1987年carmichael等将此方法用于体外细胞放射敏感性的测定，认为选用合适的细胞系，此方法可用于筛选放射增敏剂。本实验应用4种人肿瘤细胞系采用体外培养的方法，全面观察NGF的抗肿瘤作用。国外已报道NGF对一些神经和非神经肿瘤，如神经胶质瘤、前列腺癌、肺癌、乳腺癌的抗肿瘤作用机制，结果发现NGF可发挥抑制有丝分裂和抑制作用(依赖于细胞类型)。有文献报告NGF诱导肿瘤细胞分化，在人类小细胞肺癌，NGF可抑制癌细胞的增殖，阻止它们的克隆性生长，在体外可削弱它们的浸润能力，在裸鼠则消除其肿瘤生长能力，有报道认为NGF可以抑制一些胰癌细胞的侵袭。本实验结果表明，NGF在所用剂量范围内(5一卜岁Inl)对MG名03、AGZY名 3a、邢05和K%2细胞均有细胞毒作用，细胞经NGF处理后，表现活细胞数减少，细胞生长受到抑制，克隆形成能力下降，并显示对NGF