Ouabain对家兔心房机械活动的影响及其机制探讨心力衰竭(简称心衰)是指心肌细胞收缩力减弱,导致心脏泵血功能障碍。收缩能力减退的主要原因是心肌细胞的钙稳态平衡遭到破坏,细胞内钙减少,钙瞬变减弱。是多种心脏疾病晚期共同表现的一种综合征,是心源性死亡的重要原因。目前治疗心衰的药物以洋地黄类和磷酸二酯酶抑制剂(米力农、氨力农)为主。哇巴因(ouabain)是钠-钾/ATP酶(钠泵,Na+-K+/ATPase)抑制剂,是洋地黄类物质之一。内源性哇巴因(endogenous ouabain, EO)是新近发现的一种类固醇激素,也是Na+-K+/ATPase抑制剂,具有重要的病理和生理学意义。其分泌受摄盐量、血容量、肾素-血管紧张素-醛固酮系统、中枢神经系统、体内胰岛素水平以及缺氧等多种因素的调节,对机体水、电解质平衡的稳定以及血压调控等方面具有重要的作用。外源性ouabain是从夹竹桃科植物苦毒毛旋花种子中提取的,是一种快速而强效的强心甙,其作用与改变Na+-K+/ATPase活性有关。它具有抑制Na+-K+/ATPase活性的作用。在很多哺乳动物细胞中,Na+-K+/ATPase是一种能量-转换的离子泵,它可跨膜主动转运Na+和K+。研究表明,Na+-K+/ATPase可作为ouabain等洋地黄类物质的功能性受体。当Na+-K+/ATPase被抑制时,阻断细胞内Na+与细胞外K+的主动转运,引起细胞内Na+堆积,并作用到细胞膜上的一种离子交换和转运蛋白,即钠-钙交换体(Na+/Ca2+exchanger),导致细胞内Ca2+浓度的增加,从而增强心肌收缩力。这是包括ouabain在内的洋地黄类物质以及Na+-K+/ATPase抑制剂引起正性肌力效应的一般作用机制。而也有研究报道,ouabain可能激活L型Ca2+通道刺激肌浆网或内质网的Ca2+释放,从而增强心肌收缩力。另外,有学者指出,在乳鼠心肌细胞中发现,Na+-K+、ATPase也可作为信号转导物质实现信息传递的功能。他们主张,ouabain可激活Ras/MAPK信号途径,而此作用是ouabain增加细胞内Ca2+浓度的必要条件。研究报道,在人的脐动脉内皮细胞中急性处理ouabain后(处理时间为5分钟),内皮素-1(endothelin-1,ET-1)基因表达和ET-1分泌明显增多。Ouabain对ET-1的这种作用促成血管紧张性明显增高。Xavier等的研究也表明,将大鼠处理ouabain (8μg/d)5周以后,主动脉环中的ET-1和内皮素A型(ETA)受体基因表达明显上调。而且也有研究报道,ouabain可引起血浆及心脏组织中ET质量浓度明显增加,左心室ETA受体表达增强或ET-1通过激活内皮素B型(ETB)受体对心肌乳头肌发挥正性肌力作用。因此本项研究利用家兔离体搏动的心房灌流模型,观察和探讨Na+-K+/ATPase抑制剂ouabain对家兔心房机械活动影响并探讨其作用机制,为ouabain对心脏功能的作用以及临床诊治相应疾病提供理论依据。本部分结果如下：1.在离体搏动的家兔心房灌流模型中,短暂灌流ouabain (3.0μmol/L)时ouabain可明显增加心房搏出量和搏动压(与对照循环比较,均P<0.001)；而在停止灌流ouabain后的恢复期先有所下降,随即逐渐回升并达到峰值后保持较高水平(与对照循环比较,均P<0.01)。这些结果表明,ouabain可增强家兔心房机械活动。2.逆向Na+/Ca2+交换体抑制剂KB-R7943(3.0μmol/L)可完全阻断恢复期ouabain增加心房搏出量的作用,但未能改变其对心房搏动压的影响；而L型Ca2+通道阻断剂nifedipine (3.0μmol/L)不但没有阻断ouabain增加心房搏出量和搏动压的作用,反而进一步加强了ouabain对心房搏出量和心房搏动压的效应。提示,在nifedipine存在下ouabain进一步增加了细胞内Ca2+的浓度。3.非选择型蛋白激酶抑制剂staurosporine (3.0μmol/L)不能阻断ouabain增强心房机械活动的效应,ouabain增强心房机械活动与蛋白激酶途径无关。4. Ouabain (3.0和6.0μmol/L)明显增加家兔心房ET-1的分泌,且具有剂量依赖性；外源性ET-1(3.0、30.0和300.0nmol/L)明显增加家兔心房博出量,并呈现剂量依赖性特征。5.ETA受体阻断剂BQ123(0.3μmol/L)可完全阻断ouabain增加恢复期心房搏出量的效应,并明显减缓ouabain增加恢复期心房搏动压的作用；而ETB受体阻断剂BQ788(0.3μmol/L)仅明显减缓恢复期ouabain增加心房搏动压和搏出量的效应；二者共同作用时,类似于单独BQ123时的效应。表明,ouabain增强心房机械活动与其诱导的ET-1有关。6. MAPK阻断剂PD98059(30.0μmol/L可完全阻断ouabain促使ET-1生成和增强心房机械活动作用。表明,ouabain调节心房机械活动和ET-1的生成中MAPK信号转导途径发挥重要的作用。7.环氧合酶抑制剂indomethacin (30.0μmol/L)可完全阻断ouabain增加心房搏出量的作用；而心房搏动压在处理ouabain略有增加,但恢复期较快下降到对照循环水平。表明,前列腺素也参与了ouabain增强心房机械活动机制中。以上结果提示：1、Ouabain是通过抑制Na+-K+/ATPase从而激活Na+/Ca2+交换体来增强家兔心房机械活动的；2、Ouabain增强心房机械活动中MAPK信号转导通路和ET-1发挥重要的调节作用。Ouabain对家兔心房钠尿肽分泌的影响及其机制探讨心脏不仅作为泵血器官,推动血液在循环系统中流动,也可作为内分泌腺,生成和分泌钠尿肽激素(natriuretic peptide hormones)。钠尿肽激素以钠尿肽家族(family of natriuretic peptides, NPs)形式存在于人和哺乳动物体内,其成员有ANP (atrial natriuretic peptide, ANP). BNP (brain natriuretic peptide, BNP)、CNP (C-type natriuretic peptide, CNP)和DNP (dendroaspis natriuretic peptide, DNP)。这类激素主要对心脏、血管、肾脏和中枢神经系统具有参与水盐平衡、降低血压、利钠利尿、抑制细胞增殖、调节免疫、参与脂质代谢、抗氧化以及影响精子活力等作用。ANP是心房肌细胞生成和分泌的NPs家族中的第一个成员,在调节血压和维持心血管的动态平衡中起重要作用。研究表明,许多因素如心房壁的机械牵张、缺氧和内皮素-1(endothelin-1,ET-1)都和ANP分泌密切相关,其中心房的机械牵张是调节ANP分泌的最重要因素。因此,任何能影响心房肌细胞机械牵张的因素都能直接或间接地影响ANP的分泌。哇巴因(ouabain)是钠-钾/ATP酶(钠泵,Na+-K+/ATPase)抑制剂。内源性ouabain可能是由肾上腺皮质分泌的,但也有研究提示它可能来源于下丘脑,其分泌受摄盐量、血容量、肾素-血管紧张素-醛固酮系统、中枢神经系统、体内胰岛素水平以及缺氧等多种因素的调节。它可对机体水、电解质平衡的稳定以及血压调控等方面具有重要作用。而外源性ouabain是从夹竹桃科植物苦毒毛旋花种子中提取的,是洋地黄类物质之一,是一种快速且强效的强心甙,具有抑制钠泵活性的作用。研究表明,ouabain对ANP的分泌具有重要的调节作用,但其作用机制不甚明了。因此,本项研究利用家兔离体搏动的心房灌流模型,采用放射免疫、生理学及药理学等技术和方法,观察和探讨Na+-K+/ATPase抑制剂ouabain对家兔心房ANP分泌的影响及其作用机制,为研究和探讨ANP分泌机制及其功能提供实验依据。本部分结果如下：1、在离体搏动的家兔心房灌流模型中,短暂灌流ouabain(1.0、3.0及6.0μmol/L;灌流12min)时ANP分泌并没有呈现显著变化(与对照组比较P>0.05),但在停止灌流ouabain以后的恢复期内ouabain明显增加ANP的分泌(在3.0和6.0μmol/L的ouabain作用下,与对照组比较,分别P<0.01和P<0.001),且具有剂量依赖性。2、L-型Ca2+通道阻断剂nifedipine (3.0μmol/L)可完全阻断恢复期内ouabain诱导ANP分泌增多的效应；逆向Na+/Ca2+交换体抑制剂KB-R7943(3.0μmol/L)对ouabain (3.0μmol/L)诱导ANP分泌增多没有阻断效应.3、ouabain (3.0和6.0μmol/L)明显增加家兔心房ET-1的分泌,且具有剂量依赖性(与对照组比较,分别P<0.05,P<0.01)；而外源性的ET-1(3.0,30.0及300.0nmol/L)强烈促进ANP的分泌,也具有剂量依赖性(与对照组比较,分别P<0.05,P<0.01和P<0.001)。4、ETB受体阻断剂BQ788(0.3μmol/L)完全阻断了ET-1增加ANP分泌的效应;而ETA阻断剂BQ123(0.3μmol/L)部分抑制了ET-1增加ANP分泌的效应。ET-1增加ANP分泌主要是通过ETB受体途径实现的。5、ETA受体阻断剂BQ123(0.3μmol/L)没有阻断恢复期ouabain诱导ANP分泌增加的效应(与ouabain单独处理时的恢复期比较,P>0.05); ETB受体阻断剂BQ788(0.3μmol/L)完全阻断了恢复期ouabain诱导ANP分泌增加的效应(与ouabain单独处理时的恢复期比较,分别P<0.001)。6、MAPK|沮断剂PD98059(30.0μmol/L)可完全阻断ouabain增加ET-1和ANP分泌的作用。表明,ouabain增加ET-1和ANP分泌中MAPK信号通路发挥重要的作用。7、环氧合酶抑制剂indomethacin(3.0μmol/L)可完全阻断ouabain增加ANP分泌的作用。提示,ouabain增加ANP分泌的作用过程中有前列腺素参与。以上结果提示：1、Ouabain可明显增加家兔心房ANP的分泌,其作用是通过ET-1-ETB受体介导的途径实现的。2、Ouabain激活的MAPK信号通路和ET-1衍生的前列腺素在ouabain增加家兔心房ANP分泌的过程中发挥重要的调节作用。