论文部分内容阅读
第一章选择性培养牛视网膜微血管周细胞目的：选择性培养牛视网膜微血管周细胞。方法：1.应用胶原酶消化选择性培养牛视网膜微血管周细胞,台盼蓝染色检测细胞活性、倒置相差显微镜观察细胞形态；2.用α-平滑肌肌动蛋白(α-SAM)抗体、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体、Ⅷ因子相关抗原(vWf)抗体进行免疫组织化学染色鉴定牛视网膜微血管周细胞；3.应用CCK-8法测定牛视网膜微血管周细胞的增殖情况并绘制细胞生长曲线。结果：1.胶原酶消化可获得具有良好活性的毛细血管碎片,台盼兰染色显示细胞活力大于96%。原代培养1天后可见细胞从贴壁的毛细血管碎片放射状长出,3-5天后大量细胞从血管碎片迁移长出,5-7天后细胞呈长梭形,形成较大的克隆,9-10天后细胞呈短梭形达到融合状态呈可重叠生长；传代后,1小时以内细胞贴壁,1天后可见细胞完全展开,5-7天左右可以传代一次。细胞传代到第3代(P3)后逐渐出现老化状态。2.免疫组织化学染色显示细胞对α-SAM单克隆抗体染色阳性,阳性率>98%；而对GFAP抗体和vWf抗体染色阴性。3.细胞生长曲线显示,第2代细胞(P2)第4天进入对数生长期,第10天进入平台期。结论：1.经胶原酶消化成功地培养出具有高纯度和可传代的牛视网膜微血管周细胞。2.选择P2-P3代细胞能够更好的应用于后续的试验。第二章高糖诱导的牛视网膜微血管周细胞“代谢记忆”现象目的：探讨牛视网膜微血管周细胞(BRPs)从高糖培养转换为正常葡萄糖培养条件后细胞活力和细胞凋亡的变化。方法：1.BRPs高糖(20mM、25mM、30mM)条件下培养2天后转换为正常葡萄糖(5.6mM)条件下培养2天(2d-2d)、4天(2d-4d)或6天(2d-6d)；或者在高糖(20mM、25mM、30mM)条件下培养4天后转换为正常葡萄糖(5.6mM)条件下培养2天(4d-2d)或4天(4d-4d)；各时间段以全程正常葡萄糖或高糖条件下培养2、4、6、8天作为对照；细胞活力用CCK-8法评估。2. BRPs30mM高糖条件下培养4天后转换为正常葡萄糖(5.6mM)条件下培养4天(30mM4d-5.6mM4d),正常葡萄糖(5.6mM)或高糖(30mM)条件下培养4、8天作为对照；细胞凋亡的检测通过ELISA检测核小体DNA片段以及Western-blot检测活化的Caspase-3蛋白表达来评估。结果：1.20mM和25mM高糖刺激BRPs2天后,细胞活力显著降低；转换为5.6mM正常葡萄糖培养4天后细胞活力才完全恢复。30mM高糖刺激BRPs2天后,细胞活力显著降低；转换为5.6mM正常葡萄糖培养,直到6天后细胞活力才完全恢复。2.20mM和25mM高糖刺激BRPs4天后,细胞活力显著降低；即使在转换为5.6mM正常葡萄糖培养4天后,细胞活力仍未完全恢复。30mM培养条件下刺激BRPs4天后,细胞活力显著降低；但即使在转换为5.6mM正常葡萄糖培养4天后,细胞活力仍然持续性的降低。3.30mM高糖刺激BPRs4天后,细胞凋亡显著增加；即使转换为5.6mM正常葡萄糖培养4天后,细胞凋亡的异常增加仍然持续存在。结论：1.BRPs在30mM高糖条件下培养4天,细胞活力减低、细胞凋亡增多；即使转换为5.6mM正常葡萄糖条件下培养4天后,这种异常仍然持续存在,呈现“代谢记忆”现象。2.之前高糖刺激的时间、糖浓度以及之后转换为正常葡萄糖培养后的时间决定了这种“代谢记忆”的预后。第三章活性氧在高糖诱导的牛视网膜微血管周细胞代谢记忆现象中的作用及机理目的：探讨活性氧(ROS)及抗氧化物酶在高糖诱导的牛视网膜微血管周细胞(BRPs)代谢记忆现象中的作用及机理。方法：30mM高糖培养BRPs4天后转换为5.6mM正常葡萄糖培养4天；5.6mM正常葡萄糖以及30mM高糖条件下培养细胞4或8天作为对照。检测各组线粒体产生的ROS、锰超氧化物歧化酶(MnSOD)活性、MnSOD蛋白以及mRNA的表达。结果：1.30mM高糖培养BRPs4天后,细胞线粒体ROS量明显增多、MnSOD蛋白活性明显减少；即使转换为正常葡萄糖培养4天后,这种异常仍然持续存在。2.30mM高糖培养BRPs4天后,MnSOD蛋白及mRNA表达反应性增高；延长30mM高糖培养到8天或转换为5.6mM正常葡萄糖培养4天,MnSOD蛋白及mRNA的表达呈现下降趋势降低。结论：1.线粒体ROS增多、MnSOD蛋白活性的降低介导了高糖诱导的BRPs代谢记忆。2. MnSOD的转录降低涉及到BRPs代谢记忆,靶向作用于抗氧化物酶可能是一种潜在的方案去逆转高糖诱导的BRPs代谢记忆。第四章锰超氧化物歧化酶对牛视网膜微血管周细胞代谢记忆现象保护作用目的：探讨过表达锰超氧化物歧化酶(MnSOD)对高糖诱导的牛视网膜微血管周细胞(BRPs)代谢记忆的保护作用。方法：1.rAAV2-MnSOD转染BRPs,转染4、8天后检测细胞MnSOD蛋白的表达以及其活性。2. rAAV2-MnSOD预处理BRPs,检测其对30mM高糖培养BRPs4天转换为5.6mM正常葡萄糖培养4天后,线粒体活性氧(ROS)、细胞凋亡以及活化的Caspase-3蛋白表达的影响,未处理组以及5.6mM正常葡萄糖或30mM高糖培养8天作为对照。结果：1.rAAV2-MnSOD转染BRPs,4天后细胞MnSOD蛋白表达及活性明显增高,蛋白表达较对照组增加近2倍,MnSOD活性增高近1倍；转染8天后仍然检测到MnSOD蛋白的高表达并伴有蛋白活性的增高。2. rAAV2-MnSOD预处理BRPs后,30mM高糖刺激细胞4天转换为5.6mM正常葡萄糖培养4天,线粒体ROS、细胞凋亡以及活化的Caspase-3蛋白表达较未处理组以及30mM8d组明显减少,接近于5.6mM8d组的正常水平。结论：MnSOD的过表达能够导致BRPs细胞线粒体ROS产生的降低并伴有细胞凋亡的减少从而逆转高糖诱导的代谢记忆,显示MnSOD基因转染可能成为一种潜在的治疗方案去逆转糖尿病视网膜病变的代谢记忆。