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微生物与昆虫的共生是自然界普遍存在的一种现象,昆虫种类繁多,昆虫的多样性意味着昆虫共生菌的多样性。据报道,昆虫共生菌可产生结构复杂、生物活性显著的新天然产物,是活性次生代谢产物的重要来源。但当前研究者们关于该方面的探索仍不够深入。因此,以该类微生物菌群作为研究对象,分离其活性成分,旨在为充分挖掘昆虫共生菌活性次级代谢产物提供线索。本毕业论文以黑翅土白蚁(Odontotermes formsanus)和中华纺织娘(Mecopodaelongata)为主要研究对象,对其共生菌及代谢产物进行了初步研究。采用稀释平板法、形态学观察及分子生物学鉴定的方法,对黑翅土白蚁共生真菌的多样性进行了分析;采用16SrDNA测序鉴定的手段,对白蚁共生真菌的内共生细菌多样性进行了初步分析;以其中3株白蚁共生真菌BYCDW4、BYCDW8、BYSTW3与1株中华纺织娘肠道真菌FZNCD-1为研究对象,运用硅胶柱层析、葡聚糖凝胶柱(LH20)层析、半制备HPLC、反相柱((C18柱)等色谱分离技术对目标菌株的次级代谢产物进行分离纯化,利用1H-NMR、13C-NMR、HMQC、HMBC、1H-1HCOSY及HR-ESI-MS等波谱技术对代谢物的结构进行分析与鉴定,共得到9个化合物,其中有1个化合物为新天然产物。简述如下:1、对黑翅土白蚁共生真菌的多样性进行了初步研究。采用稀释平板法对白蚁共生真菌进行分离纯化,结合形态特征和5.8s rDNA基因测序对真菌进行初步鉴定。结果表明,从黑翅土白蚁中共分离纯化得到39株共生真菌,隶属于2大门,4个不同纲,15个不同属,其中包括14株潜在新菌种。以共生真菌的基因组DNA为模板,通用引物27F、1492R进行16s rDNA序列扩增,共得到9株内生细菌(9/39)的基因序列;测序结果发现其内生细菌属于2大门:厚壁菌门和变形菌门,所有细菌均包含于杆菌属,其中7株为芽孢杆菌属细菌。利用滤纸片扩散法测试了 39株白蚁共生真菌的乙酸乙酯粗提物对大肠杆菌(Escherichiacoli,ATCC 8739)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,ATCC 6633)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,ATCC 6538)和白色念珠菌(Canidia albicans,ATCC 10231)的抗菌活性,其中39株真菌中约46%的菌株具有良好的抑菌效果;约62%的菌株对金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果,其中BYCDW8、BYCDW4、BYCDW13、BYCDW19抑制效果显著,抑菌圈直径均大于20 mm;约31%、39%、15.4%的菌株分别对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌均表现出一定的抑菌效果,抑菌圈直径在6.67-21.07 mm范围内。2、对黑翅土白蚁共生菌Pleosporales目潜在新种真菌BYCDW4、BYSTW3以及Didymosphaeria属肠道真菌BYCDW8的活性代谢物进行了分离与鉴定。活性结果显示,在供试浓度为30μg/滤纸片下,菌株BYCDW4、BYCDW8粗提物对金黄色葡萄球菌的生长均具有显著的抑制作用(抑菌圈直径分别为21.28 mm、22.33 mm),强于其阳性对照药物硫酸庆大霉素(抑菌圈直径21.33 mm);对枯草芽孢杆菌具有较好的抑制作用(抑菌圈直径分别为18.45 mm、14.00 mm)。菌株BYCDW4粗提物对大肠杆菌也具有很好的抑制活性(抑菌圈直径21.07 mm)。在供试浓度为100 μg/mL时,菌株BYSTW3粗提物对苹果树腐烂病菌(Valsa mali)和苦瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerium)表现出中等强度的抑制活性,抑制率分别为54.5%和53.4%;在抗细菌活性和除草活性测试中,粗提物均表现出一定程度的抑制作用。进一步分离BYCDW4发酵液的乙酸乙酯粗提物得到1个主要的代谢物,其重量约5.4g。经分析,该产物为5-hydroxyramulosin(1):BiatriosporinM(2)=2:1的混合物。化合物1、2对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌均表现出中等生长抑制活性,其中对大肠杆菌抑制效果最为明显,抑菌圈直径为13.7 mm。从BYSTW3中分离到3个活性化合物:Physcion(3),FK-17-p2a(4),Citrinin(5)。化合物3对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均具有良好的抑菌作用,抑菌圈直径分别为23.0mm、24.2 mm、20.7 mm。化合物 3-5对稗草(EchinochoiacrusgalliL.)均表现出微弱的抑制作用,抑制率在14%-25%之间。从BYCDW8中分离得到1个新天然产物(6),其对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌表现出中等强度的抑制活性,其抑菌圈直径分别为8.32 mm、9.13 mm。3、对1株中华纺织娘肠道共生真菌Curvulariaa verruculosa FZNCD-1的活性次级代谢产物进行了研究。抗真菌活性测试发现,该菌株发酵液的乙酸乙酯粗提物对多种植物致病真菌均具有较好的生长抑制活性,半数抑制浓度IC50均在41.8μg/mL以下,其中对苹果树腐烂病菌抑制效果最为显著,其IC50<0.1μg/mL,与阳性对照药物放线菌酮效果相当。通过分离纯化与鉴定,共得到3个活性天然产物:Lunatin(7),Rheoemodin(8),CytoskyrinA(9)。在测试浓度为 100 μg/mL时,化合物7-9对苹果腐烂病菌表现出极为显著的生长抑制活性,其抑制率均大于80%;其中化合物9的抑制效果最好,抑制率达到91.7%,与阳性对照药物放线菌酮活性效果相当。化合物8-9对杨树溃疡病菌(Dothiorellagregaria)表现出较为显著的生长抑制活性,抑制率分别为94.9%和98.8%,与阳性对照药物放线菌酮抑制活性相差不大;化合物7对杨树溃疡病菌仅表现出中等强度的生长抑制活性,抑制率为66.9%。化合物8-9对番茄早疫病菌(Alternariaa so/aan)和苦瓜枯萎病菌均表现出中等强度的抑制活性,抑制率处于50.9%-69.5%之间。