【研究背景】癫痫是一种由于大脑神经元突发性异常放电引起的神经系统中的常见疾病,其起病机制复杂,发病原因众多,反复发作的癫痫可导致大脑神经元受损。已有多项研究证明癫痫的发病需经过急性期、沉默期、自发性癫痫期三个时期,其中癫痫急性期为癫痫疾病发生发展过程中的重要时期,人们认为在癫痫急性期中产生的伤害可能会逐渐演化为一些与自发性癫痫形成有关的病理生理现象,如神经元凋亡、苔藓纤维发芽、突触回路重新形成、异位细胞增殖和胶质细胞激活。花生四烯酸（Arachidonic acid,AA）是一种在人体中广泛存在的不饱和脂肪酸,既往的研究表明,在癫痫发生后AA会在大脑中堆积,继而促使神经突触谷氨酸释放增多,导致神经网络兴奋性的进一步增高。但AA的代谢在癫痫发生发展中的作用需要进一步鉴定。花生四烯酸脂氧合酶-3（Arachidonate lipoxygenase 3,ALOXE3）是AA的脂氧合酶代谢途径中的主要催化酶。我们近期发现ALOXE3在小鼠海马中与神经元共定位,且ALOXE3在小鼠海马的局部过表达可以减轻匹罗卡品诱导的癫痫的严重程度。但ALOXE3在整体动物水平上过表达在癫痫的发生发展中的作用仍未被研究。在我们的另一项研究中发现,一例Dravet综合征患者的ALOXE3启动子区域中的一个位点变异后可以使ALOXE3酶活性下降,通过该变异可使AA含量上升。综上所述,ALOXE3有可能通过参与脑中AA的代谢,在癫痫的发生发展过程中起到一定的作用,但关于其到底起到促进还是抑制作用仍需进一步探讨。【研究目的】本研究通过构建过表达Aloxe3基因小鼠模型,探索其对匹罗卡品（Pilocarpine）诱导癫痫小鼠模型急性期海马中AA含量及发作程度的影响并验证其在癫痫发生发展过程中的神经保护作用,为理解癫痫发病的机制及相关临床应用提供新的依据。【研究方法】（1）利用Piggy BAC转座酶系统,构建Thy1-Aloxe3-3XFlag过表达转基因小鼠模型,用PCR鉴定初代阳性小鼠。并用Western blot及RT-q PCR实验验证过表达转基因小鼠后代海马中ALOXE3蛋白及m RNA的表达水平。（2）采用观测及测量称重方法对比Aloxe3过表达转基因小鼠和WT小鼠在外表、身长及体重的差异。（3）采用Western blot分析了WT及转基因小鼠癫痫急性期时的ALOXE3蛋白表达水平,ELISA实验分析AA在8周龄WT小鼠匹罗卡品癫痫模型急性期海马、Aloxe3过表达转基因小鼠匹罗卡品癫痫模型急性期海马、WT小鼠对照组海马及Aloxe3过表达转基因小鼠对照组海马中的含量。（4）采用行为学观测方法检测8周龄WT小鼠及Aloxe3过表达转基因小鼠在小鼠癫痫急性期的癫痫发作程度。（5）采用Western blot分析了WT及转基因小鼠在癫痫沉默期（10 d）小鼠海马中ALOXE3的蛋白表达水平。（6）采用荧光玉染色（Fluoro-Jade C,FJC）及电镜观察实验方法检测8周龄WT小鼠匹罗卡品癫痫模型沉默期海马、Aloxe3过表达转基因小鼠匹罗卡品癫痫模型沉默期海马、WT小鼠对照组海马及Aloxe3过表达转基因小鼠对照组海马CA1及CA3中神经元损伤情况及海马中神经元及线粒体的形态变化。（7）采用行为学观测方法检测8周龄WT小鼠匹罗卡品癫痫模型及Aloxe3过表达小鼠匹罗卡品癫痫模型在自发性癫痫期的癫痫自发情况。【研究结果】工具鼠的建立:（1）构建Aloxe3过表达转基因小鼠模型,使用PCR技术验证了初代阳性鼠并用Western blot及RT-q PCR验证了其后代海马中ALOXE3的过表达效果。（2）通过观测、测量及称重证明了Aloxe3过表达转基因小鼠与同周龄WT小鼠相比其外表、身长及体重无区别。以上说明Aloxe3过表达转基因对小鼠表型无影响。ALOXE3过表达在急性期的作用:（1）通过Western blot实验证明了癫痫急性期（12 h）中小鼠海马中ALOXE3蛋白水平表达下降（**P<0.01）,ELISA实验证明了ALOXE3过表达可使AA在癫痫急性期小鼠海马中的含量减少（**P<0.01）,说明ALOXE3过表达可逆转由SE的导致的ALOXE3蛋白表达水平下降,并同时调节海马中AA含量。（2）通过行为学观测WT小鼠及Aloxe3过表达小鼠癫痫急性期发作程度行为学结果显示,与WT小鼠相比,Aloxe3过表达小鼠在首次肌肉阵挛性抽动、强直性后肢伸展、死亡的潜伏期和持续5 s以上的阵挛性惊厥均明显延长,且死亡率降低（*P<0.05）。以上说明ALOXE3过表达可使小鼠癫痫急性期发作程度减轻。ALOXE3过表达在沉默期的作用:（1）通过Western blot实验证明了Aloxe3过表达可使小鼠匹罗卡品癫痫模型癫痫沉默期（10 d）中的ALOXE3蛋白表达水平上调（*P<0.05）,说明Aloxe3过表达可逆转由于小鼠由于进入癫痫沉默期导致的ALOXE3蛋白水平表达下降。（2）FJC结果显示Aloxe3过表达转基因小鼠在癫痫沉默期中海马CA1及CA3损伤神经元明显减少（*P<0.05）,说明ALOXE3过表达在小鼠癫痫沉默期对海马神经元有保护作用。（3）电镜结果显示在小鼠癫痫沉默期中,Aloxe3过表达转基因小鼠海马中的神经元及线粒体形态轻度异常,WT小鼠海马中的神经元及线粒体形态重度异常,说明ALOXE3过表达在小鼠癫痫沉默期中对海马神经元及线粒体有保护作用。ALOXE3过表达在自发性癫痫期的作用:（1）观测WT小鼠及Aloxe3过表达转基因小鼠自发性癫痫期行为学结果显示,Aloxe3过表达转基因小鼠在发作频率及发作持续时间上较WT小鼠明显减少（*P<0.05）。以上提示ALOXE3过表达可减少小鼠匹罗卡品癫痫模型自发性癫痫的严重程度。【结论】本研究表明ALOXE3过表达可通过降低匹罗卡品癫痫小鼠模型癫痫急性期海马中AA的含量,使癫痫急性期发作程度下降,在癫痫疾病发生发展中对神经元起到保护作用,最终缓解自发性癫痫发作程度。本研究在整体动物上验证了ALOXE3过表达的神经保护作用,为寻找癫痫潜在治疗靶点提供了数据。