胰腺癌（pancreatic cancer）是消化道恶性程度极高的常见恶性肿瘤之一,其中以胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）最为常见。近年来我国胰腺癌的发病率居高不下,东部地区及东北部地区的胰腺癌发病率已超过西方传统高发国家的平均水平。目前手术切除治疗仍被认为是临床上针对PDAC治疗的最佳手段,然而每年新发的胰腺癌患者中,仅有10—20%经评估后可行手术。胰腺癌治疗效果不佳,病死率和发病率相近,5年生存率极低,预后极差。探索胰腺癌发生发展机制及新的治疗手段迫在眉睫。内质网氧化还原酶 1α（endoplasmic reticulum oxidoreductase 1 alpha,ERO1L）位于内质网（endoplasmic reticulum,ER）,是一种含有黄素腺嘌呤核苷酸的酶分子,参与二硫键形成。ERO1L通过有效地重新氧化脯氨酰4-羟化酶β/蛋白质二硫键异构酶（proly1 4-hydroxylase beta/protein disulfide isomerase,P4HB/PDI）,接受被还原的PDI的电子并传递给分子氧,催化形成分泌蛋白和细胞表面蛋白的二硫键,同时也导致细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）的产生。这是免疫球蛋白正常折叠的必要条件。研究证实ERO1L在多种恶性肿瘤,如肺癌、胃癌及乳腺癌中呈高表达,在肿瘤生长、转移、血管生成和免疫逃逸等方面起到了重要作用,与肿瘤患者预后密切相关。但目前关于ERO1L在胰腺导管腺癌中表达的研究仍十分有限,其作用机制尚待进一步探索。本课题首先通过胰腺癌肝转移全外显子组及转录组测序联合公共数据库数据筛选出胰腺癌相关基因ERO1L。并进一步研究ERO1L在胰腺癌中的表达及其与预后相关性,验证ERO1L对胰腺癌细胞生物学功能的影响,最后阐明ERO1L调控胰腺癌发生发展及转移的可能分子机制。本学位论文由以下四部分组成:第一部分 胰腺癌肝转移全外显子组及转录组测序筛选胰腺癌相关基因ERO1L目的:借助全外显子组及转录组测序技术筛选胰腺癌肝转移相关基因。方法:收集了 17名肝转移的胰腺导管腺癌患者的同期手术切除的样本。31个石蜡组织样本被用于提取DNA并进行全外显子组测序。33个新鲜组织样本提取RNA进行转录组测序。生物信息学分析测序数据。结果:胰腺癌原发灶与肝转移灶的基因组突变一致性较高;细胞干性相关的基因在疾病环境的样本中高表达;在肿瘤组织中活性上调的通路呈现多种不同的变化趋势;炎症及免疫反应或在胰腺癌肝转移中起到重要作用结论:同一患者胰腺癌原发灶与转移灶转录组异质性小。在肿瘤发生过程中,肿瘤组织与周围非肿瘤组织有共同改变;在疾病进展过程中,肿瘤细胞通过自身转录组的变化,以及其与周围组织之间的联系来为自己创造有利的条件。免疫相关基因在胰腺癌中高表达,为胰腺癌的治疗提供了新的可能性。第二部分 ERO1L在胰腺癌中的表达及其与预后相关性目的:研究内质网氧化还原酶1α（ERO1L）在胰腺癌组织中的表达情况及其与胰腺癌预后的相关性。方法:搜集205例胰腺导管腺癌组织及配对的癌旁正常胰腺组织制作胰腺癌组织芯片;提取Oncomine,TCGA,GTEx公共数据库中正常组织及肿瘤组织包括胰腺癌的表达数据结果:ERO1L在不同肿瘤中表达水平不同,在多种肿瘤包括但不限于宫颈鳞状细胞癌、宫颈腺癌、肺腺癌、胰腺导管腺癌中呈高表达,Kaplan-Meier生存分析表明ERO1L的表达模式与患者预后呈负相关,ERO1L表达较高的胰腺胰导管腺癌（PDAC）患者的总生存率比ERO1L表达较低的患者短（P=0.0078）。通过免疫组化染色发现,与正常胰腺组织相比,人类胰腺上皮内瘤变（PanIN）和PDAC组织中ERO1L蛋白表达水平升高。肿瘤大小（P=0.002）和组织学分化（P=0.033）在高ERO1L表达组和低ERO1L表达组之间存在显著差异。结论:ERO1L在PDAC组织中表达上调,其表达情况与患者的肿瘤大小、组织学分化显著相关,ERO1L是胰腺癌预后不良的预测因子,胰腺癌组织中的ERO1L表达水平越高,其预后越差。第三部分 ERO1L对胰腺癌细胞生物学功能的影响目的:研究使用ERO1L抑制剂,过表达及敲减不同人胰腺癌细胞系中ERO1L表达水平对胰腺癌细胞增殖,迁移和侵袭作用的影响。方法:构建稳定转染ERO1L干扰胰腺癌细胞系及使用ERO1L抑制剂,应用CCK8、平板克隆实验等方法检测处理后胰腺癌细胞增殖能力变化。应用transwell小室检测胰腺癌细胞侵袭迁移能力的变化。动物实验检测抑制剂处理后对小鼠肿瘤大小及肝转移情况影响。结果:ERO1L在不同人胰腺癌细胞系中均呈高表达,使用短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）在两个ERO1L蛋白水平较高的PDAC细胞系（Capan-2和MiaPaCa-2）中沉默ERO1L,ERO1L的表达水平在这两个细胞系中显著下降（＞80%）,同时这两个细胞系中PDAC细胞的迁移和侵袭能力也受到抑制。另外,体外细胞实验和动物实验均表明药理性抑制ERO1L的表达能够显著限制PDAC细胞的生长、迁移、侵袭等肿瘤发生发展过程。结论:ERO1L在不同人胰腺癌细胞系中均呈高表达,抑制ERO1L的表达可限制PDAC细胞的生长、迁移、侵袭,为胰腺癌的治疗提供了一种新的潜在靶点。第四部分ERO1L调控胰腺癌分子机制研究目的:探索ERO1L调控胰腺癌增殖及侵袭,迁移的潜在分子机制。方法:生物信息学分析探索ERO1L在胰腺癌中发挥作用的可能机制;内质网应激抑制剂处理胰腺癌细胞系研究其对ERO1L表达的影响;应用Seahorse能量分析仪检测细胞氧消耗速率（OCR）和胞外酸化率（ECAR）,应用试剂盒检测培养上清中葡萄糖的消耗和乳酸生成量研究ERO1L对胰腺癌有氧糖酵解的影响。结果:内质网应激化学诱导剂处理胰腺癌细胞结果显示可激活ERO1L及内质网应激相关蛋白的表达。TCGA数据分析发现ERO1L表达与UPR,低氧及糖酵解通路相关,葡萄糖摄取实验发现干扰ERO1L降低了胰腺癌细胞的糖摄取。干扰ERO1L表达后抑制了有氧糖酵解,促进了氧化磷酸化。过表达ERO1L促进了胰腺癌细胞有氧糖酵解,抑制了其氧化磷酸化。半乳糖较葡萄糖进入有氧糖酵解效率低,ERO1L高表达后通过有氧糖酵解显著增强胰腺癌细胞增殖生长,使用糖酵解抑制剂2-FDG及2-DG显著抑制了 ERO1L的促增殖生长作用。GSEA分析显示ERO1L可能通过EMT促进胰腺癌转移,进一步细胞实验显示:干扰ERO1L或使用抑制剂后E-cardherin上调,Vimentin下调,抑制了 EMT通路。结论:内质网应激诱导了胰腺癌细胞中ERO1L的表达,促进了胰腺癌细胞的有氧糖酵解水平并通过激活有氧糖酵解促进胰腺癌细胞增殖生长。另外ERO1L通过激活EMT促进胰腺癌肝转移。