基因治疗已成为恶性肿瘤研究领域的热点和发展趋势，其核心策略之一就是通过基因重组等手段将目的DNA转染入肿瘤细胞内，诱导肿瘤细胞的凋亡达到治疗疾病的目的。选择能高效特异地增强肿瘤细胞凋亡作用的目的基因，成为该领域研究的关键和难点问题。 TNF(tumor necrosis factor，肿瘤坏死因子)是由正常人单核／巨噬细胞产生的一种对多种肿瘤细胞具有特异性杀伤作用的细胞因子，可通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥其抗肿瘤活性。研究表明TNF的促细胞凋亡作用是通过与细胞表面TNFR1(tumor necrosis factor receptor 1，肿瘤坏死因子受体1)结合而实现的。当TNFR1接受TNF的信号刺激后，其下游的TRADD(TNFR-associated death domain protein，TNF受体相关死亡结构域蛋白)可通过同源性的DD(death domain，死亡结构域)间的相互作用与TNFR1直接结合，也能使TNFR1与FADD(Fas-associated death domain protein，Fas相关死亡结构域蛋白)通过三者的DD间接结合，进而引起FADD的DED(death effect domain，死亡效应结构域)寡聚化，导致细胞凋亡。因而在这条凋亡的信号传导通路中，TNFR1及FADD基因发挥着非常重要的作用。 舌癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，易通过淋巴和血液循环通路全身转移，分化程度低的中、晚期病例术后易复发，放、化疗效果均不满意，预后较差。舌癌位置表浅，直视性强，对其进行基因治疗具有天然优势。本课题采用了分子生物学和细胞生物学的技术路线和实验方法，通过构建含有 贫 口 旱 匡大学派土学位论文2003．05IN’－－RI及FADD基因功能结构域的融合基因TFL，并将之稳定转染入人舌癌细胞系之中表达融合蛋白’fN’FRltoED活性，观察后者在rhTN’F－a作用下介导舌癌细胞凋亡的功效，以期得到良好的实验结果，为临床应用提供理论依据。 为了证实FADD基因对于舌癌细胞的诱导凋亡活性，我们将真核表达质粒PIRESZEGFP－FADD瞬时转染入舌癌细胞Tcasl 13中，利用间接兔疫荧光等方法证实了人FADD蛋白在舌癌细胞中的表达。借助荧光显微镜观察到，与PIRESZEGFP空载体转染组比较，FADD转染的细胞在转染后24小时即出现变圆、皱缩、出泡等改变；电镜观察结果显示胞膜出泡、染色质固缩及凋亡小体形成等典型的凋亡细胞形态；倒置显微镜观察到：FADD基因转染组培养液中可见大量的悬浮细胞，而空载体转染组细胞仍贴壁生长，状态良好，仅见少量的悬浮细胞。细胞计数结果显示，转染FADD基因的实验组细胞存活数均明显少于同时期转染空载体的对照组细胞。细胞周期检测发现，转染FADD基因的舌癌细胞在36h后出现凋亡峰。这些结果表明：FADD基因过表达具有快速、高效诱导人舌癌细胞凋亡的活性。 将融合基因TFL及pcDNA3空载体分别稳定转染入Tcasll3细胞基因组DNA中，建立细胞系TTFL及TpC，利用RTPCR及间接免疫荧光等方法鉴定融合基因的整合情况，并从细胞周期、形态学改变等方面比较建系细胞与亲本细胞的生物学性状差异。发现转染有融合基因TFL的TTFL细胞与亲本细胞Tea8113在生物学性状方面无明显差别；融合蛋白IN：FRltoED己经在TTFL细胞中表达活性。将rh硼－a（recombinant hu。an TN’F－a，人重组肿瘤坏死因子l）分别作用于Tea七、Tgc及TTFL细胞，结果显示：thw－a对T－TFL细胞的杀伤作用呈现明显的剂量和时间依赖关系，T－TFL细胞的IC。为1．3 ng／ml，。而其他两种细胞的IC。在1000 ng／ml以上，说明T－TFL细胞对rhTN’F川的敏感性比亲本细胞及转染空载体的细胞均有明显提高；流式细胞法检测rhTN’F－口可使TTFL细胞在作用后72h出现明显的凋亡；DNA降解片段琼脂糖凝胶电泳观察TTFL细胞基因组DNA分解成寡聚核音酸片段，有“梯形条带”形成；形态学观察经rhTNF．口作用后的TTFL细胞有胞膜出泡，染色质浓缩、边集等细胞凋亡特征，说明rhTN’F－a通过融合蛋白TNFRI／DED介导舌癌细胞凋亡。 将 Tea七 细胞、TTFL细胞分别接种于 BALB儿裸鼠皮下，成瘤后肌 Dpartment Oforal and Maxllofctal Surg6ry－4－ 京 口 旱 巨大学傅士攀位枪丈2皿3折肉注射 ibM－a（5 u g／次），二天一次，共 5次。结果注射 il’M’－．a后，Teasll3细胞移植瘤组瘤体积呈进行性增大，为开始治疗时的427％，而接种TTFL细胞的移植瘤明显缩小，只有开始的8．9％，表明融合蛋白TN’FRI／DED在体内也能有效地介导rhTNF－a对舌癌细胞的杀伤作用，IU’u－－L染色阳性说明fhwiI是通过诱导细胞凋亡的方式发挥其体内杀伤作用；通过对裸鼠生长状况及内脏器官的组织学检查发现，能使肿瘤体积明显缩小的hTN’F－a的剂量对机体无明显的毒副作用。 在融合蛋白TN’FRltoED对舌癌细胞系药物和辐射敏感性的影响实验中我们观察到：通过MTT比色法显示：含有融合基因TFL的细胞TTFL对环磷酞胺（CTX人 阿糖胞昔（ia（人紫杉醇（Taxol），氨甲蝶吟（MTX人长春地辛（VDS），平阳霉素（PYM），氟尿啼唆（5．Fu）