生物乙醇是一种可再生的清洁能源,目前主要由植物原料生产,正逐渐成为汽油的替代燃料。Clostridium aceticum（C.aceticum）是一种严格厌氧的乙酸产生菌,它既能以H₂+CO₂为能源和碳源自养生长,又能以果糖、丙酮酸、延胡索酸为碳源异养生长。C.aceticum可通过Wood-Ljungdahl途径将H₂+CO₂转化为乙酰辅酶A,并进一步代谢产生乙酸。乙醛铁氧还原蛋白酶（Aldehyde Ferredoxin Oxidoreductase,AOR）严格无氧条件下能将乙酸还原为乙醛,乙醛可进一步还原为乙醇。对AOR酶的研究表明,来自于菌株Pyrococcus furiosus和Thermococcus sp.ES-1的AOR酶具有乙酸还原活性。本论文通过将AOR酶基因过表达,对野生型C.aceticum进行代谢改造,以重组质粒的形式将乙酸还原酶AOR的编码基因转到野生型菌株,使重组型C.aceticum能利用CO₂产生乙醇。本论文的研究结果为构建利用CO₂产生乙醇的工业微生物提供了新的途径:（1）C.aceticum AOR酶的生物信息学分析:先从C.aceticum的基因组中的查找到4个AOR酶编码基因,进行多重序列比对后构建基于AOR酶氨基酸序列的分子进化树,以进化关系为基础选出编号为WP₄4825795.1和WP₄4824935.1的两个AOR蛋白。对序列进行足迹定位分析,最终得到注释为dhV、AFOR_N和AFOR_C的结构域,说明这两个蛋白具有与Thermococcus sp.EP1和P.furiosus AOR酶相似的功能。（2）C.aceticum AOR酶的结构预测:蛋白的二级结构预测表明,编号为WP₀44825795.1的AOR酶和P.furiosus AOR酶更具相似性,造成AOR酶蛋白结构差异的来源,主要为螺旋（H）其次为折叠结构（E）。通过同源建模预测三级结构,结果表明模板蛋白和目标蛋白的结构不同区主要集中在保守区域的端点处,保守区域内部的结构高度一致。（3）AOR酶编码基因上下游序列分析:可视化基因组序列,结果显示AOR编码基因阅读框的方向与上下游基因相反,表明aor基因有一个单独的启动子。寻找并分析AOR酶编码区上下游的序列,结果表明,在-10到-15位点的区间“AGGAGG”为AOR酶编码基因的核糖体结合位点,在-17到-26位点的区间为“TATTTTTTAAA”Pribnow框。（4）C.aceticum过表达AOR酶基因的代谢预测:重构C.aceticum全基因组酶蛋白的代谢反应途径,结果显示C.aceticum全基因组酶主要作用在生物代谢、遗传信息处理、环境信号处理、细胞过程、有机系统和致病系统。对C.aceticum重组菌的代谢预测表明,由于AOR酶的过表达,重组菌中的乙酸最终被还原成乙醇,且推测过表达菌株还有可能会产生L-乳酸,甲酸和三羧酸循环中的中间产物。（5）AOR酶基因过表达C.aceticum的构建:根据前面的分析设计三对引物aor-prim,aor-prim2和aor-prim3,以引物的最佳退火温度进行PCR扩增,通过连接、转化、筛选和验证,得到三个重组质粒p MTL82151_thl_aor,pMTL82151_thl_aor2和pMTL82151_thl_aor3。将重组质粒转化到E.coli CA434,在通过结合将质粒结合转到C.aceticum中,经筛选和验证,得到过表达aor,aor2和aor2的重组型C.aceticum。（6）野生型和重组型C.aceticum的代谢产物分析:C.aceticum菌株的发酵结果显示,野生型菌株和含有质粒pMTL82151_thl_aor的重组菌的代谢产物为乙酸,从果糖利用和乙酸产生情况来看,在本研究的发酵条件下,C.aceticum能利用CO₂。含有质粒pMTL82151_thl_aor2和pMTL82151_thl_aor3的重组菌的代谢产物包括琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸和乙醇。