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目的:检测白血病干细胞中是否有AQP1(水通道蛋白)与AQP9(水-甘油通道蛋白)的表达,判断其与白血病细胞异常增殖间可能存在的关系。
方法:
①采用MACS法分离纯化白血病患者骨髓中CD34+CD38-细胞,FACS检测分离纯化程度;
②实验分组:白血病干细胞组、白血病非干细胞组、白血病红细胞组、正常干细胞组、正常非干细胞组、正常红细胞组,外周血白细胞组和外周血红细胞组为阳性对照组,Western blot检测各组中AQP1与AQP9蛋白的表达;
③RT-PCR检测各组中AQP1与AQP9 mRNA的表达;
④甘油试剂盒检测各组中甘油的有无及含量;
⑤瑞氏-姬姆萨染色观察纯化干细胞形态。
结果:
①纯化后各细胞比例:CD34+CD38+细胞占60.06％,CD34+CD38+细胞占35.15％,CD34-CD38-细胞占5.47％,CD34-CD38+细胞占1.32％;
②Western blot结果显示白血病干细胞组与正常干细胞组均无AQP1蛋白表达,白血病非干细胞组、白血病红细胞组、正常非干细胞组、正常红细胞组、外周血白细胞组和外周血红细胞组AQP1蛋白表达分别为:0.97±0.01、0.95±0.03、0.96±0.02、0.94±0.03、0.95±0.03、0.95±0.02,但无统计学差异(P＞0.05),AQP9蛋白仅在阳性对照外周血白细胞组中有表达;
③RT-PCR结果显示白血病干细胞组与正常干细胞组均无AQP1 mRNA表达,白血病非干细胞组、正常非干细胞组、外周血白细胞组AQP1mRNA表达分别为:0.91±0.02、0.86±0.03、0.95±0.02,但无统计学差异(P＞0.05),AQP9 mRNA仅在阳性对照外周血白细胞组中有表达;
④甘油试剂盒检测结果显示各组细胞内均含有甘油,白血病干细胞组、白血病非干细胞组、白血病红细胞组、正常干细胞组、正常非干细胞组、正常红细胞组、外周血白细胞组和外周血红细胞组,各组的甘油含量(μg/ml)分别为:73.17±4.25、60.83±6.01、65.43±6.50、104.00±4.58、91.17±4.37、97.43±5.06、86.73±4.25、92.33±2.75,且组间比较有统计学差异(P＜0.001)。白血病干细胞组与正常干细胞组、白血病非干细胞组与正常非干细胞组、白血病红细胞组与正常红细胞组、白血病干细胞组与白血病非干细胞组、正常干细胞组与正常非干细胞组的两两比较均有统计学差异(P＜0.05),且正常组均高于白血病组、干细胞组均高于非干细胞组。白血病干细胞组、正常干细胞组、白血病非干细胞组与外周血白细胞组比较有统计学差异(P＜0.05),正常非干细胞组与外周血白细胞组比较无统计学差异(P＞0.05)。白血病红细胞组与外周血红细胞组比较有统计学差异(P＜0.05),正常红细胞组与外周血红细胞组比较无统计学差异(P＞0.05);
⑤油镜下,骨髓涂片和干细胞涂片均可见形态大小一致的原始细胞,这些细胞呈圆形或椭圆形。核圆或稍呈椭圆,或不规则,几乎占据细胞的全部,位于正中或偏于一侧,染淡紫红色。核染色质纤细,分布均匀,无任何浓集深染现象,核膜整齐,很薄。有核仁3～6个,常在2个以上。胞浆很少,无颗粒,染淡蓝色。
结论:
①白血病干细胞与正常骨髓干细胞中均无AQP1表达,而白血病非干细胞与正常骨髓非干细胞中均有AQP1表达,可以推测:细胞的功能代谢活动越旺盛,其细胞内水的代谢也越活跃;
②白血病干细胞、正常骨髓干细胞、白血病非干细胞、正常骨髓非干细胞中均有一定含量的甘油存在,且正常组均高于白血病组、干细胞组均高于非干细胞组,提示细胞内甘油含量与细胞增殖状态有关,甘油含量越高,增殖速率越低,增加细胞内甘油含量可能有助于降低肿瘤细胞的增殖速率;
⑨白血病干细胞、正常骨髓干细胞、白血病非干细胞、正常骨髓非干细胞中均有一定含量的甘油存在,但均无AQP9表达,说明这些细胞内存在其它甘油内外交换途径。