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研究背景正畸治疗通过错畸形的矫治使牙颌颅面形态取得新的平衡和协调关系,而高效的正畸治疗需要对正畸牙齿移动精准的控制。正畸牙齿移动的实现依赖于外部机械力刺激下的牙槽骨骨改建。牙槽骨改建是骨吸收与骨形成的动态平衡。正畸力下,破骨前体细胞于牙周膜局部募集并破骨向分化,形成骨吸收陷窝,继而牙槽骨受压侧骨吸收,受牵拉侧骨形成,牙齿开始移动。骨改建过程受到局部微环境的精密调控。其中局部血管形成对成骨与破骨过程均起到正向支持作用。血管形成是指从已存在的血管基础上出芽形成新的血管,包括内皮细胞的增殖,迁移及小管形成等过程,受到组织中缺氧信号,分泌蛋白,非编码RNA等因素调控,可作为影响骨改建的途径之一。此外,国内外学者也已经证明促进体内血管形成可以加速正畸牙齿移动。已有研究证明牙槽骨中成骨向分化的牙周膜干细胞可通过影响内皮细胞血管形成调节牙槽骨改建。而同样在骨改建中起关键作用的破骨细胞是否也对牙周膜血管形成有调控作用从而影响正畸骨改建进程则尚无文献报道。此外,正畸治疗中关键的外部机械力又是否参与了破骨细胞对内皮细胞的调控也未明确。同时,骨改建是多种细胞相互影响彼此调控的生理过程,因此参与胞间交流的重要介质外泌体可以在骨改建中起到重要作用。外泌体是携带有RNA和蛋白质的小膜泡（直径30-150nm）,其中关键的调控物microRNA（miRNA）已被证明可从多方面影响骨改建。那么破骨细胞分泌的外泌体及其携带的miRNA是否参与了破骨细胞对内皮细胞的影响,此胞间调控作用又会对牙槽骨骨改建及正畸牙齿移动有何影响?值得我们进一步研究。实验目的本研究旨在通过体内外实验探究压力作用下破骨细胞分泌的外泌体及其携带的microRNA对内皮细胞血管形成能力的影响;探索miRNA-146a-5p（miR-146a）及脂联素（ADP）影响血管形成的作用机制,明确miR-146a对大鼠正畸牙齿移动的影响,为正畸及血管形成调控的临床应用提供理论基础。实验方法1.构建大鼠体内牙齿加力模型,检测加力7d及14d后受压侧牙周膜破骨细胞分化情况及牙周膜血管生成变化。2.体外诱导THP-1细胞系破骨向分化,建立体外细胞受压力模型,探究机械压力对破骨细胞分化的影响。3.通过共培养实验探索破骨细胞对脐静脉内皮细胞（HUVECs）是否有胞间调控作用;在HUVECs中分别添加提取自受压力破骨细胞的外泌体（EXOf）以及提取自未受压破骨细胞的外泌体（EXO）后,进行实时荧光定量PCR（Real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR）、蛋白免疫印迹（Western Blot）、迁移实验、划痕实验及小管形成实验以探究破骨细胞对HUVECs增殖,迁移,小管形成的影响。4.对加力前后的破骨细胞miRNA表达进行高通量转录组测序（RNA-seq）。通过qRT-PCR、Western Blot、迁移实验、划痕实验及小管形成实验检验miR-146a对HUVECs增殖,迁移,小管形成的影响以及胞内CD31,VEGF及ADP等基因表达的影响;通过双荧光素酶实验验证miR-146a与ADP的靶标关系。5.通过qRT-PCR验证miR-146a在破骨细胞外泌体EXO及EXOf中的表达差异;在HUVECs中分别添加EXOf以及EXO后验证胞内miR-146a,CD31,VEGF及ADP的表达。6.向 HUVECs 中转染靶向 ADP 的干扰 RNA（si-ADP）,通过 qRT-PCR、Western Blot、迁移实验、划痕实验及小管形成实验探究ADP的表达对内皮细胞增殖,迁移,小管形成的影响。7.向内皮细胞转染miR-146a-5p inhibitor及mimics后使用Western Blot技术探究miR-146a/ADP的下游通路。8.注射适量agomiR-146a-5p及antagomiR-146a-5p于大鼠受力牙齿牙周膜中,观察miR-146a-5p对大鼠牙齿移动的影响及组织学变化。实验结果1.体内模型加力7d、14d后大鼠受力牙齿牙周膜中破骨细胞标志物TRAP及血管标志物CD31表达量增高2.体外诱导破骨细胞分化过程中,破骨细胞标志物表达升高,破骨细胞诱导成功;破骨分化过程中向细胞层施加梯度机械压力后,TRAP染色结果显示破骨细胞数量增加,qRT-PCR及Western Blot结果显示胞内TRAP表达量不同程度增高,这些结果证明机械压力对破骨细胞的分化起促进作用。3.与破骨细胞共培养的HUVECs增殖率升高,抑制破骨细胞分泌外泌体可减弱此促进作用;加入破骨细胞外泌体后的HUVECs增殖,迁移及小管形成能力增强,且EXOf相比EXO表现出更明显的促进作用。4.加力后的破骨细胞相比未受力破骨细胞中有67个miRNA表达下调,170个表达上升。其中miR-146a在破骨细胞受压力后下调,miR-146a inhibitor促进HUVECs的增殖,迁移,小管形成及胞内CD31,VEGF及ADP的表达而miR-146a mimics对HUVECs血管形成能力及胞内ADP的表达有抑制作用。进而双荧光素酶实验证明ADP为miR-146a的靶基因。5.miR-146a在EXOf中的含量少于EXO;加入EXOf的HUVECs中miR-146a表达量低于加入EXO的HUVECs。加入破骨细胞外泌体EXOf和EXO的HUVECs血管形成能力增强,VEGF、CD31及ADP等基因表达升高,且EXOf相比EXO的促进作用更大。6.ADP可以促进HUVECs的增殖,迁移,小管形成能力,转染si-ADP减少胞内ADP的表达后HUVECs的迁移及小管形成能力下降,CD31、VEGF表达量减少。7.转染miR-146ainhibitor可以促进HUVECs中ERK通路及Akt通路的磷酸化而miR-146amimics则起到相反作用。转染si-ADP同样可以降低磷酸化ERK（p-ERK）及磷酸化Akt（p-Akt）的表达。证明miR-146a/ADP可通过激活HUVECs中ERK通路及Akt通路影响血管生成。8.牙周膜局部注射miR-146a抑制剂antagomiR-146a大鼠的牙齿移动量多于对照,伴随牙周膜血管形成增加;牙周膜局部注射miR-146a模拟剂agomiR-146a大鼠的牙齿移动量少于对照,伴随牙周膜血管形成减少。结论机械压力促进破骨细胞分化并降低破骨细胞内miR-146a的表达,降低的miR-146a通过外泌体影响内皮细胞中ADP的表达,继而激活ERK、Akt通路以促进内皮细胞血管形成,对体内正畸力下牙槽骨骨改建及牙齿移动速度产生影响。