骨骼肌(skeletal muscle,SKM)主要起源于轴旁中胚层演化出来的体节,体节内的原始成肌祖细胞经过初级肌发生和次级肌发生两个阶段,最终发育成胎儿肌肉,成肌祖细胞也逐渐演变为SKM干细胞。出生后,新生胎儿肌肉的质量和体积不断生长,直至发育为成年SKM。同时,SKJM干细胞的数量在出生后3周内逐渐减少,最终定位在肌纤维膜与基底膜之间,形成成年SKM干细胞池,即SKM卫星细胞。成年SKM是人体最丰富的组织,可占人体重的30-40%,如此庞大的组织体系可适应其应有的生理功能和各种损伤刺激引起的应激性反应,表现出强大的可塑性和适配性。在多种SKM损伤刺激条件下,成年SKM的适配性反应主要体现在两个方面:一是SKM自身的损伤,如急性创伤、肌营养不良症等,此种情况下,卫星细胞被激活,启动成肌程序,再生出新的肌纤维或修复现有肌纤维;二是SKM自身以外因素引起的肌形态改变,如恶病质、长期应用糖皮质激素、失神经支配等,此种情况下,SKM表现为质量和体积的减小,即SKM萎缩。本课题分别对肌损伤再生适配过程和肌萎缩适配过程这两种情况进行探讨,深入探究不同损伤刺激因素下成年SKM适配的分子机制,为SKM相关疾病的临床治疗提供新的潜在靶点和实验依据。第一部分蛋白激酶Pim1对肌卫星细胞介导的骨骼肌再生的调控作用及机制背景由于成年骨骼肌(skeletal muscle,SKM)本身所固有的干细胞储备功能,因此SKM损伤后具有强大的再生能力。SKM干细胞又称为肌卫星细胞(satellite cells,SCs),位于肌纤维膜与基底膜之间。一旦SKM受到损伤,静止的SCs立即被激活,开始分裂增殖、定向分化,最后融合形成新的多核肌纤维,或者修复部分受损的现有肌纤维。这些过程的调控与SCs内一系列成肌调节因子的表达级联反应具有密切关系。静止状态的SCs仅表达肌特异性调节因子Pax7,而激活状态的SCs遵循成肌系谱的表达模式,开始表达肌分化调节因子Myf5、MyoD,从而决定SCs进入成肌分化程序。定向分化的SCs逐渐上调myogenin和MRF4,并且下调Pax7,从而进入终末分化融合阶段。其中,一小部分增殖的SCs逐渐下调MyoD,维持Pax7,重新进入静止状态,更新补充SCs的储备。因此,SCs的增殖、分化、融合以及自我更新,对SKM损伤后再生修复起着决定性作用。然而,广泛肌肉创伤或严重肌病导致的SCs过度消耗或功能缺陷,将会难以启动SKM再生程序。因此,探讨SCs的自我更新、增殖、分化和融合的分子机制,对操控SCs功能和重启SKM再生修复能力具有重要的实际应用价值。SCs增殖、分化、融合、自我更新等一系列行为受到多种信号通路的调控,其中蛋白激酶作为哺乳动物细胞内极其重要的一类信号蛋白,在SCs功能的调节过程中占据着非常关键的地位。但是目前已报道的蛋白激酶,对SCs功能的调控作用仅仅体现在SCs的某一状态,亦或是促进某一状态,而抑制另一状态。同时,SCs的增殖、分化、融合、自我更新又是一个交错序贯的过程,因此目前这些蛋白激酶靶点的应用均需注意SKM再生各阶段时间窗的选择问题,这无形中增加了临床实际应用的难度。因此,本课题拟探寻新的调控以上多个环节的关键蛋白激酶,检测其在SKM损伤再生过程中的表达模式,揭示其对SCs增殖、分化、融合以及SKM再生过程的影响,为临床靶向干预SKM再生修复提供新的思路和依据。方法1 SKM再生过程中差异蛋白激酶的筛选及实验验证1.1在Gene Expression Omnibus(GEO)数据库寻找并下载SKM损伤再生模型的表达谱芯片数据,利用R语言及生物信息学分析,筛选差异表达的蛋白激酶。1.2 使用10-12w雄性C57BL/6J小鼠,通过右侧胫骨前肌(tibialis anterior,TA)注射10μl生物毒素notexin(NTX,10μg/ml),建立肌损伤再生模型。在NTX注射3d、7d、14d、28d后,蛋白质免疫印迹(western blot,WB)与qPCR检测Pim1在TA肌中的表达变化。2 蛋白激酶Pim1在肌损伤再生模型中的功能研究2.1 构建Pim1基因敲除小鼠,选取野生型(Pim1+/+)与缺失型(Pim1-/-)小鼠,测量出生后各周龄体重和下肢SKM肌湿重,计算肌湿重占体重的百分比;H&E染色观察下肢肌肉形态。2.2 选取Pim1+/+与Pim1-/-小鼠,建立肌损伤再生模型,qPCR检测Pim1在TA肌中的表达,明确Pim1的敲除效率。在肌损伤后14d,H&E染色检测中央核肌纤维(再生肌纤维)横截面积(cross-sectional area,CSA)。3 Pim1对C2C12成肌细胞系和原代SCs增殖、分化、融合的影响3.1 构建携带小鼠Pim1 shRNA(shPim1)干扰序列的慢病毒(lentivirus,Lv)载体,通过Lv-shPim1转染C2C12成肌细胞,建立Pim1低表达C2C12细胞系。WB检测Pim1的表达,明确Pim1的敲低效率。3.2 利用正常C2C12成肌细胞系和Pim1低表达C2C12细胞系,CCK-8试剂盒检测细胞数量;EdU试剂盒检测细胞增殖率;TUNEL试剂盒检测细胞凋亡率;WB检测抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x1、pBad的表达。3.3 原代SCs体外培养,Lv-shPim1转染原代SCs,IF标记Pax7、MyoD,统计Pax7阳性及MyoD 阳性细胞比例。3.4 C2C12成肌细胞诱导分化,qPCR、WB检测Pim1在不同分化天数时的表达。在原代SCs增殖状态,IF标记MyoD、Pim1,在分化状态,IF标记MyHC、Pim1,观察Pim1在肌细胞中的定位情况。在C2C12细胞增殖及分化后1d、3d、5d,胞浆胞核蛋白分离提取,分别检测Pim1蛋白在胞浆、胞核内的表达变化。3.5 C2C12成肌细胞诱导分化,使用Pim1激酶抑制剂TCS PIM-1 I(TCS)(终浓度25μM、50μM),WB检测myogenin、MyHC、myomerger的蛋白表达;qPCR检测Myog、Tnni2、Ckm、Mylpf、Acta1、Mymk、Mymx的mRNA表达;IF标记MyHC及细胞核,计算分化指数、融合指数。3.6 原代SCs体外诱导分化,应用TCS抑制Pim1激酶活性,IF标记MyHC及细胞核,计算分化指数、融合指数。3.7 构建酶失活型Pim1(K67M)、MyoD表达质粒,海肾荧光素酶报告质粒,以及以MyoD的DNA结合核心序列为启动子的萤火虫荧光素酶报告质粒。转染C2C12成肌细胞并诱导其分化,结合TCS处理,检测荧光素酶活性。结果1 蛋白激酶Pim1在SKM损伤再生过程中表达上调1.1 在GEO数据库下载肌损伤再生小鼠模型芯片数据GSE67032,选取野生型对照组和野生型NTX处理组数据,利用R语言limma包筛选两组间差异基因(fold change≥2,p<0.01),共得到差异基因2703个,其中,上调1634个,下调1069个。根据GO富集分析,得到73个参与蛋白磷酸化过程的具有蛋白激酶活性的基因,Pim1即是上调的蛋白激酶之一。根据Pim1促进细胞生存生长等关键作用的最新研究进展,因此我们将蛋白激酶Pim1作为本课题的研究对象。1.2 WB与qPCR结果显示,在NTX处理3d、7d,TA肌中Pim1蛋白和mRNA表达均显著上调,此时期恰好是SCs增殖、分化的高峰期;而NTX处理14d、28d后,Pim1的表达恢复正常。2 敲除Pim1阻碍SKM损伤后再生2.1 虽然Pim1-/-小鼠各周龄体重较Piml1+/+明显减轻,但是TA肌与腓肠肌(gastrocnemius,GAS)相对肌湿重无明显差异;H&E染色显示Pim1-/-小鼠各周龄下肢肌肉无肌病表现。2.2 Pim1+/+与Pim1-/-小鼠肌损伤模型建立后,qPCR显示Pim1在TA肌中无表达,证明Pim1基因已被敲除。肌损伤后14d,Pim1-/-小鼠TA肌平均中央核肌纤维CSA占对侧肌CSA的比例显著减小。3 蛋白激酶Pim1促进C2C12成肌细胞和原代SCs增殖、分化、融合3.1 Lv-shPim1转染C2C12成肌细胞,WB显示Pim1的表达明显下调,表明Pim1低表达C2C12细胞系建立成功。3.2 在Pim1低表达C2C12细胞系,CCK-8结果显示C2C12细胞数量显著降低;EdU结果显示C2C12细胞增殖明显减少;TUNEL结果显示C2C12细胞凋亡明显增加;WB显示Bcl-2、Bcl-x1、pBad蛋白显著下调。3.3 Lv-shPim1转染原代SCs,IF显示Pax7阳性及MyoD 阳性细胞比例均显著降低。3.4 C2C12成肌细胞诱导分化,qPCR、WB显示Pim1的表达随着细胞分化逐渐上调。IF结果显示Pim1在肌SCs增殖时主要定位在胞浆,而在诱导分化后,Pim1大部分转位进入胞核。胞浆胞核蛋白分离提取,WB显示胞浆Pim1与胞核Pim1在细胞分化第3d均显著上调,且胞核Pim1主要为磷酸化形式。3.5 在诱导分化的C2C12细胞,Pim1激酶抑制剂TCS明显抑制了 myogenin、MyHC、myomerger的蛋白表达,以及Myog、Tnni2、Ckm、Mylpf、Acta1、Mymk、Mymx的mRNA表达;IF结果显示细胞分化指数、融合指数也在TCS处理后显著降低。3.6 TCS处理分化的原代SCs,IF结果显示分化指数、融合指数均明显降低。3.7 荧光素酶活性检测结果显示,在C2C12细胞诱导分化后,酶失活型Pim1(K67M)及Pim1抑制剂TCS均显著抑制MyoD的转录活性。结论1 蛋白激酶Pim1在肌损伤后迅速上调,且Pim1上调时间窗与SCs增殖、分化高峰期相吻合。2 在肌损伤再生模型中,敲除Pim1显著抑制肌纤维的再生修复。3 蛋白激酶Pim1促进成肌细胞增殖、分化、融合等一系列过程,从而发挥促进SKM再生的功能。4 蛋白激酶Pim1通过介导成肌调节因子MyoD的转录活性,从而调控成肌分化过程中SKM特异基因的表达。第二部分甲基转移酶CARM1促进骨骼肌萎缩的作用及其分子机制背景骨骼肌(skeletal muscle,SKM)作为躯体运动的最终执行者,在人类日常生活和工作中扮演着不可替代的角色。然而,在多种病理状态下,如慢性疾病、癌症、营养不良、长期应用糖皮质激素、失神经支配等,SKM就会发生形态的萎缩和功能的缺陷,从而严重降低肌萎缩病人的生活质量。因此,深入探究SKM萎缩发生发展的分子机制,对病理条件下维持SKM组织的正常生理结构和功能具有非常重要的临床意义。共激活因子相关精氨酸甲基转移酶1(coactivator-associated arginine methyltransferase 1,CARM1)是蛋白精氨酸甲基转移酶(protein arginine methyltransferase,PRMT)家族的一员。在分子功能上,CARM1发挥着双重作用,既可作为甲基转移酶,又可作为与转录因子结合的共激活因子。在生物学功能上,CARM1及其甲基转移酶活性是哺乳动物个体发育必不可少的,展示了 CARM1强大的生理功能。在SKM细胞中,既往研究强调了 CARM1与SKM发育之间的密切联系,CARM1对肌细胞的分裂和分化具有显著的促进作用。但是,CARM1在不同的疾病状态下同样发挥着病理作用。例如,参与肿瘤的发生和代谢,促进周围神经损伤诱导的痛觉过敏等。然而,CARM1对成年SKM萎缩的影响及其内在机制目前尚不清楚。因此,本课题将从以下几个方面探究CARM1在SKM萎缩发展过程中的作用和机制:1、检测CARM1在SKM萎缩发展过程中的表达模式,探究CARM1与肌萎缩进展之间的联系。2、研究CARM1对肌萎缩的影响,明确CARM1在肌萎缩发展过程中的作用。3、研究CARM1与Fox03的关系,探寻CARM1促进肌萎缩的分子机制。4、研究CARM1在肌纤维自噬过程中的作用,探讨CARM1对自噬-溶酶体蛋白降解途径的影响。方法1 CARM1在失神经诱导肌萎缩模型中的表达变化及其与肌湿重的关系1.1 使用8-10w雄性C57BL/6J小鼠,通过右侧坐骨神经切断建立失神经(denervation,Den)肌萎缩小鼠模型,在Den 3d、7d、2w、4w,蛋白质免疫印迹(western blot,WB)检测CARM1 在胫骨前肌(tibialis anterior,TA)和腓肠肌(gastrocnemius,GAS)中的表达变化。1.2 在Den 3d、7d、2w、4w,取双侧TA与GAS肌,称量肌湿重,计算Den侧肌湿重占对侧的百分比,分析TA与GAS肌湿重的变化差异,建立CARM1表达变化与肌湿重变化之间的联系。2 CARM1在失神经诱导肌萎缩模型中的功能研究2.1 构建携带小鼠CARM1 shRNA(shCARM1)干扰序列的腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV),通过AAV-shCARM1 肌肉注射敲减CARM1,WB与qPCR检测CARM1的表达,明确CARM1在TA肌中的敲低效率。2.2 AAV-shCARM1肌肉注射4w后,建立Den诱导肌萎缩模型。在Den 2w、4w,称量TA肌湿重;H&E染色测量肌纤维横截面积(cross-sectional area,CSA);WB检测肌球蛋白重链MyHC的蛋白表达;qPCR检测萎缩相关基因Atrogin1、MuRF1、MUSA41mRNA的表达。3 CARM1在地塞米松诱导肌萎缩模型中的功能研究3.1 AAV-shCARM1肌肉注射4w后,通过腹膜腔注射地塞米松(dexamethasone,Dex)(10mg/kg/d)连续4w,建立Dex诱导肌萎缩模型。在Dex注射4w后,称量TA肌湿重;H&E染色测量肌纤维CSA。3.2 通过CARM1靶向siRNA(siCARM1)转染,在C2C12肌管中敲减CARM1。随后建立Dex(终浓度100μM)诱导的C2C12肌管萎缩模型,WB与qPCR检测CARM1的表达,明确CARM1在C2C12肌管中的敲低效率;免疫荧光(immunofluorescence,IF)技术标记MyHC,测量C2C12肌管直径;qPCR检测Atrouin1、MuRF1 mRNA的表达。4 CARM1对转录因子Fox03的调控机制研究4.1 在体外Dex诱导的C2C12肌管萎缩模型或体内Den诱导肌萎缩模型中,WB检测Fox03和pFox03(S253)蛋白水平。4.2 在Dex诱导的肌管萎缩模型中,使用IF检测CARM1与Fox03在C2C12肌管内定位情况,以及是否存在共定位。4.3 在Dex诱导的肌管萎缩模型和Den诱导肌萎缩模型中,免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)检测CARM1 与Fox03 相互作用,免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)检测Fox03精氨酸位点非对称性双重甲基化(asymmetric di-methylation,me2a)修饰水平。5 CARM1甲基转移酶活性对Fox03转录活性与肌管萎缩的影响5.1 在Dex诱导的肌管萎缩模型中,使用CARM1甲基转移酶抑制剂(CARM1 methyltransferase inhibitor,CARM1i)处理C2C12肌管,qPCR检测Fox03靶基因Atrogin1和MuRF1的mRNA表达情况;IF标记MyHC,测量C2C12肌管直径。6 CARM1对肌纤维自噬的调控作用6.1 在Dex诱导C2C12肌管萎缩模型或Den诱导肌萎缩模型中,应用siCARM1或shCARM1转染技术敲低CARM1的表达,WB检测LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的蛋白水平;IF检测肌管内LC3-Ⅱ的点状聚集情况;qPCR检测自噬相关基因LC3b、Becn1、Bnip3、Ctel、Atg5、Atg12、Atg13、Atg1的mRNA水平;WB检测Atg1 3、Atg14的蛋白水平。结果1 失神经肌萎缩后肌湿重的丢失伴随着CARM1蛋白的增加1.1 WB结果显示,Den 2w和4w,虽然TA肌中CARM1蛋白表达与有神经支配(innervation,Inner)组无明显差异,但是在GAS肌中CARM1蛋白水平较Inner组显著上调。1.2 称量肌湿重结果显示,Den 2w和4w,GAS肌湿重的减少相对于TA肌更加明显。表明Den后CARM1蛋白上调越显著,肌萎缩程度就越严重。2敲减CARM1可以延缓Den诱导的SKM萎缩2.1 WB与qPCR结果显示,在Inner和Den TA肌,AAV-shCARM1转染均可以显著减少CARM1蛋白和mRNA的表达。2.2 在Den 4w后,相比shCtrl组,shCARM1组TA肌湿重占对侧肌的比例增加了8.8%(shCtrl 48.54±0.32%,shCARM1 57.34±1.01%);TA肌平均肌纤维CSA百分比(相对于对侧肌CSA)明显增加了 14.83%(shCtrl 50.49±4.00%,shCARM1 65.32±2.63%);在分子水平上,敲低CARM1显著增加了TA肌球蛋白重链MyHC的蛋白水平,敲低CARM1可以明显减少萎缩相关基因Atrogin1和MuRF1 mRNA的表达。3敲减CARM1可以抵抗Dex诱导的SKM萎缩3.1 在Dex诱导肌萎缩4w后,AAV-shCARM1转染可以有效减少肌湿重的丢失;H&E结果显示,AAV-shCARM1转染显著增加了TA肌的平均肌纤维CSA(shCtrl 1695.3±61.1μm2,shCARM1 1896.6±41.8μm2)。3.2在Dex诱导C2C12肌管萎缩模型中,WB和qPCR证实C2C12肌管中转染siCARM1可以诱导CARM1蛋白和mRNA表达下调。IF显示,siCARM1转染明显阻止了肌管直径的减小(siCtrl 12.04±0.51μm,siCARM1 25.46±1.37μm);qPCR显示,萎缩相关基因Atrogin1和MuRF1 mRNA水平在siCARM1转染后也明显下调。4 CARM1与转录因子FoxO3相互作用并催化FoxO3发生非对称双重甲基化4.1 在体外Dex诱导的肌管萎缩模型与体内Den诱导的SKM萎缩模型中,WB显示FoxO3蛋白明显上调。然而,敲减CARM1并不影响FoxO3总蛋白和Ser253磷酸化水平。表明CARM1的下调对肌萎缩的延缓作用并不是通过改变FoxO3蛋白水平及其细胞内定位来实现的。4.2 IF结果显示,CARM1主要分布在C2C12肌管细胞核内。在Dex诱导肌管萎缩后CARM1与FoxO3在细胞核中存在共定位现象。4.3 Co-IP进一步揭示,内源性CARM1与FoxO3在C2C12肌管中存在相互作用。此外,在Den诱导SKM萎缩小鼠模型中,Co-IP也显示了CARM1和FoxO3的相互结合。IP结果显示FoxO3在C2C12肌管中发生精氨酸位点me2a修饰,尽管甲基化程度在对照组和Dex处理中相似。然而,在体内实验中,FoxO3的me2a修饰水平在Den的GAS肌中增加了 2.5倍,这一结果可能是由于Den GAS肌中CARM1蛋白上调的缘故。5 FoxO3转录活性和肌管萎缩需要CARM1介导的甲基化修饰5.1 在Dex诱导C2C12肌管萎缩模型中,qPCR显示CARM1i可以显著减少FoxO3靶基因Atrogin1和MuRF1的转录水平;IF结果显示,CARM1i显著抑制了 C2C12肌管直径的减小(Ctrl 14.15±1.22μm,CARMli 24.14±1.49μm)。6 CARM1参与调控肌纤维自噬6.1 在C2C12肌管中,WB显示Dex促进了非脂化型LC3-Ⅰ向脂化型LC3-Ⅱ的转化,而siCARM1转染可以明显抑制LC3-Ⅱ的形成,表现为LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的降低;IF显示siCARM1转染后肌管内点状LC3-Ⅱ聚集显著减少,表明肌管内自噬小体的数量明显降低。在Den诱导的肌萎缩模型中,AAV-shCARM1转染明显抑制了LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化;qPCR与WB显示自噬相关基因Atg13和Atg14在shCARM1转染后明显下调。结论1 CARM1蛋白在Den肌萎缩模型中表达上调,且CARM1蛋白上调伴随着明显的SKM质量丢失。2 在肌萎缩诱导条件下,通过RNA干扰技术敲低CARM1可以有效减轻SKM萎缩的程度。3 CARM1与肌萎缩过程中关键的转录因子Fox03发生相互作用,并且使其精氨酸位点发生非对称性双重甲基化修饰。4 CARM1依赖的甲基化修饰是Fox03的转录活性和C2C12肌管萎缩进展所必需的。5 CARM1作为重要的自噬调控分子,在体内体外均可促进肌细胞自噬。