目的 研究人外周血单核细胞来源的树突状细胞（Dendritic cells，DC）体外诱导、扩增方法以及生物学特性，进一步在体外和动物模型上研究DC在抗乙肝病毒和肝癌免疫中的作用，为DC疫苗在临床上的应用提供理论依据。方法1．人外周血单核细胞来源的树突状细胞体外诱生方法和生物学特性 1．1 从健康人外周血中分离出单核细胞，在rhGM-CSF和rhIL-4的 作用下培养7-22天，并通过形态学观察、FACS分析（检测DC 表面特异性标记CDla及DC功能相关分子HLA-ABC、HLA-DR、 CD40、CD86的表达）和混合淋巴细胞反应进行鉴定。 1．2 EBV感染PBMC建立EBV转化的B淋巴母细胞系，用该细胞和DC 负载抗原后刺激自体淋巴细胞的增殖效应来比较两种细胞的抗 原提呈能力。2．DC抗乙肝病毒免疫 2．1 取正常人和慢性乙肝病人的外周血，按前述方法诱导扩增出DC， 并用流式细胞仪检测CD40表达情况。 重庆医科人学博卜学位论义 2．2检测乙肝表面抗原＊BSAg）负载的 DC刺激自体淋巴细胞增殖 效应。 2．3用PLXSN＊真核表达载体转染HepGZ 细胞，建立表达HBsAg的 。靶细胞摸型；检测DC诱寺的HBsAg特并性CTI。对HePGZ—S细胞 的杀伤效应。 2．4用HBsAg特异性CTL与HepG。＊细胞同时接种BALB／C裸鼠或用 HBsAg特异性CTL治疗HepG。上荷瘤裸鼠模型，观察肿瘤的发生 和生长情况u瘤大小用最大径与最小径的乘积来表示，nz）。 3．DC抗肝细胞癌免疫 3．l 从健康人外周血中分离出单核细胞，在rhG卜CSF和 rhIL叫或 rhGM｛SF作用下培养7天，分别诱导出同一个体来源的DC和巨 噬细胞＊巾人 用肿瘤抗原负载的细胞刺激自体淋巴细胞增殖 效应来比较两种细胞对肝癌细胞抗原＊）的提呈作用。 3．2 DC体外激活产生肿瘤特异性CTL并检狈对CTL对HepGZ 细胞的 杀伤效应。 3．3用HepGZ细胞接种于裸鼠背部皮下，建立肝癌细胞荷瘤裸鼠模 型：OC激活的肿瘤特异性CTL和LAK细胞分别对He＊2荷瘤裸 e 鼠模型进行治疗，比较它们的治疗效果。 结果 1．人外周血单核细胞来源DC的鉴定和生物学特性 1．1 在枷｛SF和IL、作用－卜，培养7天即可诱导出典型的＊。经 3 罩庆医科大学博I＿学位论义 ＊W 光学显微镜和电镜观察及流式细胞仪分析证实，所诱导的细胞 具有典型DC 的形态学和结构特征；表达DC特异性表面标记 CDla，同时高表达功能十关分于HI。A－ABC、HLA－DR，CD40于 CD86；．混合淋巴细胞反应的检测表明，DC具有较强的刺激同种淋巴细 胞反应的能力。 1．2负载抗原的DC刺激自体淋巴细胞增殖的能力强于朋V转化的淋 巴母细胞，说明DC具有更强的抗原提呈能力。 2．DC抗乙肝病毒免疫 2．IHBSAg负载的m不仅诱导自体淋巴细胞增殖，而且其激活的 HBSAg特异性CTL具有很强的杀伤效应，杀伤率为85．l巩 2．2在接种后的 22大内，预防接种组荷瘤率为 20％门乃），而对照 组为90％（9／10），有显著性差异（g（。05）；DC激活的HBSAg 特异性CTL对HepG厂S荷瘤鼠模型有治疗作用，在接种后的38 大内，治疗组肿瘤明显比对照组小，有显著性差异k们．05）， 而且治疗组有 3只荷瘤鼠肿瘤消退“0们。 3．DC抗肝细胞癌免疫 3．1被肝癌细胞抗原致敏的队或M巾有显著刺激自体淋巴细胞增殖元 效应，而以DC的刺激能力更强c 3．2 DC激活的肿瘤特异性 CTL具有很强的杀伤效应，杀伤率为 71．6耿 3．3 DC激活的肿瘤特异性 CTL有抑制肿瘤生长的作用，明显强于 LAK 细胞的治疗效果b州．05人 4 重庆医科大学博十学位论文 结论 1．人外周血单核细胞在GM｛SF和 IL个的诱导下，可以分化为典型的 树突状细胞，并具有较强的抗原提呈功能。 2．立表达HBSAg的肝癌细胞荷瘤裸鼠模型，通过观察HBSAg?