背景:白癜风是一种常见的获得性色素脱失性皮肤病,全球发病率约0.5%-2%。由于其特殊的临床表现,常给患者带来严重的心理负担。白癜风的发病机制尚不明确,因此缺乏有效的治疗方法。大量研究表明,氧化应激在白癜风的发生发展中发挥关键作用。我们及国内外其他课题组发现,氧化应激可以产生包括H₂O₂在内的氧自由基,诱导黑素细胞凋亡和免疫异常,形成级联反应,进一步造成黑素细胞损伤。凋亡是一种可调控的程序性细胞死亡,阻断凋亡信号通路,可明显改善氧化应激对黑素细胞的损伤。近来发现,氧化应激不仅引起细胞凋亡,还可以诱导细胞出现另一种程序性死亡方式,即程序性坏死。黑素细胞在氧化应激环境下是否发生程序性坏死尚无报道。受体相互作用蛋白1（RIP1,也叫RIPK1）是RIP家族中第一个成员,最初发现于TNF信号通路。当TNF与细胞膜表面TNF受体（TNFR）结合,TNFR与接头蛋白TRADD相互作用,进而招募RIP1及具有泛素调节功能的TRAF2、IAPs和LUBAC复合体形成复合体I,促进MAPKs和NF-κB活化。当细胞状态改变,受到翻译后修饰,RIP1受到某些蛋白泛素化/去泛素化修饰时,RIP1与FADD、caspase-8形成复合体IIa,诱导凋亡发生;当caspase-8被抑制,RIP1与RIP3形成复合体IIb,即necrosome,并促使RIP3磷酸化,激活的RIP3诱导混合系列蛋白激酶样结构域（MLKL）磷酸化,p-MLKL向细胞膜转位,破坏其完整性,导致细胞死亡,这一过程称为程序性坏死。由此可见,RIP1在细胞的生死存亡中至关重要。有研究表明,高浓度叔丁基过氧化氢（t-BHP）建立的内皮细胞氧化应激模型中,t-BHP促进RIP1和RIP3相互作用,诱导内皮细胞出现程序性坏死。使用siRNA沉默RIP1、RIP3、MLKL或RIP1抑制剂necrostatin-1（Nec-1）、MLKL抑制剂necrosulfonamide（NSA）预处理内皮细胞,均能减少t-BHP诱导的细胞死亡。在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和人白血病Jurkat细胞中,敲除RIP1能显著减少H₂O₂诱导的细胞死亡。基于以上研究,我们提出如下假说:第一,RIP1在氧化应激诱导黑素细胞程序性坏死中发挥至关重要的作用;第二,白癜风黑素细胞对氧化损伤更敏感,可能与氧化应激上调RIP1、RIP3、MLKL,并促进necrosome形成更多更早有关。目的:1.氧化应激下,正常人和白癜风患者黑素细胞中RIP1及相关程序性坏死信号分子的表达,明确其在黑素细胞氧化损伤中的作用;2.探讨RIP1及其下游分子参与氧化损伤黑素细胞的分子机制。方法:1.通过共聚焦显微镜观察白癜风患者表皮残存的黑素细胞中p-RIP3和p-MLKL的表达情况,明确是否存在程序性坏死。2.用H₂O₂处理人永生化黑素细胞系PIG1和白癜风患者永生化黑素细胞系PIG3V,通过CCK-8实验检测细胞活性,流式细胞术检测两种细胞的坏死（PI⁺）率。同时,使用Real-time PCR和Western blot分别检测RIP1 mRNA和蛋白表达情况。3.在PIG1和PIG3V中分别使用慢病毒搭载的RIP1 shRNA（LV-RIP1-shRNA）感染细胞、MLKL干涉片段转染细胞或Nec-1、NSA预处理细胞,通过CCK-8和流式细胞术检测氧化应激下的细胞活力和PI⁺率。4.使用H₂O₂处理PIG1和PIG3V,通过共聚焦显微镜观察RIP1和RIP3共定位情况和p-MLKL细胞膜转位情况。5.通过免疫沉淀技术,证实H₂O₂处理下PIG1和PIG3V细胞中RIP1和RIP3相互结合。6.在LV-RIP1-shRNA感染或者Nec-1预处理PIG1和PIG3V情况下,给予H₂O₂刺激,通过流式细胞术观察线粒体ROS的变化;PIG1和PIG3V给予线粒体ROS清除剂mito-TEMPO预处理,通过CCK-8检测氧化应激下的细胞活力;免疫沉淀技术观察mito-TEMPO预处理对氧化应激条件下,黑素细胞RIP1和RIP3相互作用情况。7.通过Western blot检测1.0mM H₂O₂处理下,敲低RIP1或Nec-1预处理后PIG1和PIG3V细胞的MAPKs通路变化。结果:1.组织免疫荧光结果显示,白癜风患者皮损残存的黑素细胞中可检测到程序性坏死相关分子p-RIP3和效应分子p-MLKL,而在正常人表皮的黑素细胞中未检测到p-RIP3和p-MLKL。2.1.0mM H₂O₂处理PIG1和PIG3V 24h,PI⁺细胞显著增多,且PIG3V PI⁺细胞多于PIG1。此外,氧化应激模型中,PIG1和PIG3V的RIP1 mRNA和蛋白均上调,呈现时间依赖性。3.敲低RIP1或者Nec-1预处理PIG1和PIG3V均能增加氧化应激下的细胞活力,减少PI⁺细胞;同样,MLKL敲低后,氧化应激下PIG1和PIG3V的细胞活力升高,NSA预处理显著增加PIG1和PIG3V氧化应激下的细胞活力。4.H₂O₂处理PIG1和PIG3V 6h和12h,细胞免疫荧光结果显示,在6h组PIG3V中可观察到RIP1和RIP3共定位显著增加,而且p-MLKL向细胞膜转位,这些现象的出现均早于PIG1细胞。5.免疫沉淀实验证实,H₂O₂处理条件下,PIG1和PIG3V细胞中RIP1和RIP3相互结合呈现时间依赖性增加,Nec-1预处理后两者结合被抑制。6.敲低RIP1或者Nec-1预处理PIG1和PIG3V均能减少氧化应激下的线粒体ROS水平。使用mito-TEMPO预处理PIG1和PIG3V,再给予H₂O₂刺激12h,一定程度增加细胞活力;但是H₂O₂刺激24h后,mito-TEMPO预处理与H₂O₂组的细胞活力无明显差异。免疫沉淀实验结果显示,H₂O₂刺激12h,mito-TEMPO预处理可一定程度减少RIP1和RIP3相互结合;而H₂O₂刺激24h,mito-TEMPO预处理对RIP1和RIP3相互作用无明显作用。7.氧化应激条件下,敲低RIP1和Nec-1预处理对PIG1和PIG3V细胞的MAPKs活化无明显影响。结论:氧化应激诱导黑素细胞necrosome形成,促使程序性坏死效应分子MLKL磷酸化,进而p-MLKL向细胞膜转位,破坏细胞膜完整性。PIG3V相较于PIG1更容易遭受氧化损伤,可能由于其necrosome的形成及p-MLKL细胞膜转位发生更早。此外,氧化应激诱导的线粒体ROS升高也一定程度加重细胞损伤。在临床组织样本中检测发现白癜风患者表皮黑素细胞p-RIP3和p-MLKL阳性,证实细胞学实验结果。通过本课题的研究,我们首次发现程序性坏死是黑素细胞氧化损伤的方式之一,为白癜风的发病机制提供了新思路。