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异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是目前治疗恶性血液病和其他系统恶性疾病最有效的方法之一,近十年来非清髓异基因造血干细胞移植(NST)由于其安全高效的优势而得到快速发展。NST主要包括非清髓预处理和移植前后免疫治疗两个方面,其中的免疫治疗相对来说更为重要,它通过供者免疫细胞诱导的移植物抗白血病(GVL)效应可达到延长患者治疗后缓解期、消除白血病微小残留病(MRD)等目的。目前临床上应用最广泛的供者淋巴细胞输注(DLI)是移植后细胞免疫治疗的经典方案,但实践中逐渐发现DLI具有诱发移植物抗宿主病(GVHD)、骨髓抑制和继发性再障等不足,为此,近年来我们开展了供者动员后外周血干细胞移植物输注(DSI),研究发现DSI不仅可以达到较好的GVL效应,而且还有可减少GVHD的发生、预防骨髓抑制等优点,具有取代DLI的临床潜力。随着allo-HSCT和过继性细胞免疫治疗的蓬勃发展,供者动员后外周血干细胞移植物(G-PBSC)在临床上的地位越来越重要,已经成为干细胞移植和细胞免疫治疗的主要来源。但此前大部分针对G-PBSC的研究都集中于其中少量的造血干细胞,随着临床治疗方案的改进,G-PBSC的免疫效应也日益受到重视,而目前临床应用G-PBSC的方法均为采集后直接输注,细胞的免疫效应并不能完全发挥。因此,如何诱导和增强G-PBSC的GVL效应同时保证安全性的体外活化策略是目前亟需探讨的课题。我们在文献调研和预实验的基础上,从物理刺激和化学诱导两类方法中分别选择了低强度He-Ne激光以及重组人白细胞介素21(rhIL21)进行了以下研究。第一部分实验我们首先利用不同剂量密度的低强度He-Ne激光体外照射供者动员后外周血,随后分离单个核细胞分组培养。通过CCK-8法证实了0.9-4.5J/cm~2的低强度He-Ne激光对体外培养的供者动员后外周血单个核细胞(G-PBMNC)具有促进增殖作用,并确定了其量效关系,筛选出了最佳剂量密度;同时利用CFDA-SE/PI流式双染法检测了各组G-PBMNC体外对K562细胞的杀伤效应,结果证明激光在改变G-PBMNC增殖活性的同时对其杀伤能力有正向调节作用,并得出了诱导细胞毒性最强的照射剂量;我们还利用流式细胞术检测了激光对供者G-PBMNC培养24-72小时后T细胞亚群的影响,结果显示激光照射后72小时内T细胞CD3~+CD4~+和CD3~+CD8~+亚群未发生明显变化;利用流式四色染色法检测了T细胞中Th和Tc亚群分泌IFN-γ和IL-4的能力,探讨了激光对G-PBMNC免疫调节作用的机制,观察到激光虽对诱导IL-4分泌无明显作用,但可刺激IFN-γ的分泌,并确定了诱导IFN-γ分泌的两个最佳照射剂量;最后我们通过染色体畸变实验和微核实验证实了0.9-4.5J/cm~2照射剂量的低强度He-Ne激光体外照射对供者G-PBMNC没有染色体致畸效应,在该范围内应用安全可靠。虽然IL2对一些恶性肿瘤的免疫治疗有效,但考虑到其在免疫调节中的矛盾作用以及剂量依赖性毒性的限制,寻找肿瘤免疫治疗替代品的任务仍很艰巨。第二部分实验我们应用新发现的免疫刺激因子——IL21及相关细胞因子组合体外诱导培养供者G-PBMNC,通过CFDA-SE/PI流式双染法证实了rhIL21于体外可以增强供者G-PBMNC的抗瘤活性,且与rhIL2诱导效果相当,进一步应用rhIL21取代rhIL2对传统的细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞诱导体系进行改良并取得了良好的体外杀伤效果,证实了rhIL21具有取代rhIL2的临床治疗潜能;我们还通过对多种不同细胞因子组合的比较,筛选出了可获得最强细胞杀伤效应的诱导体系,为供者G-PBMNC的体外增效提供了新的策略;我们继续利用流式细胞术检测上述细胞因子及组合诱导供者G-PBMNC后7天内T细胞亚群和NK细胞亚群的变化,分析了不同诱导方案对供者G-PBMNC中免疫细胞成分的影响,发现筛选的最佳诱导体系在诱导CD3~+CD8~+、CD3~-CD56~+和CD3~+CD56~+细胞亚群方面均有明显优势;我们还利用荧光定量RT-PCR方法检测了与免疫细胞功能相关的效应分子Perforin、Granzyme B和IFN-γ在不同时间点的分泌情况,进一步阐明了活化后G-PBMNC细胞杀伤效应的机制;最后我们为了对筛选出的最佳诱导方案进行效果评价,将其与目前临床应用最广泛的CIK细胞诱导体系进行了细胞杀伤能力和细胞亚群诱导能力方面的比较,结果证实该细胞因子组合在诱导CIK细胞方面较传统CIK细胞诱导体系更具优势。